Influence of dermal equivalent maturation on the development of a cultured skin equivalent

Histologie and Îmmunofluorescence methods were used to analyse the presence of fibronectin, chondroitin-4-sulphate and chondroitin-6-sulphate, type III and IV collagens, laminin, and keratins to assess the maturation level of cultured dermal and skin equivalents. ln a first phase, fibroblasts in monolayer culture were compared with dermal equivalents in which fibroblasts are embedded in a type 1 collagen gel. Different fluorescent patterns were observed depending on the culture system used. A sequential appearance of macromolecules was noticed in dermal equivalents. Fibronectin was first detected after 4 days of culture, whereas chondroitin-4-sulphate and chondroitin-6-sulphate and type III collagen were present after 7 days. ln cOntrast, aIl three macromolecules were detected at 24 h of culture in fibroblastic monolayer cultures. ln a second phase, the quality of our skin equivalents was evaluated according to the seeding time of epidermal cells upon dermal equivalents (1, 4, or 7 days). A satisfactory stratification was obtained when keratinocytes were seeded after 4 and 7 days of dermal equivalent culture. Laminin and fibronectin were detected at the dermo-epidermal junction, but type IV collagen was absent. Various keratins, as detected by the ABl, AB2, and AB3 antibodies, were present in the epidermallayer. Following keratinocyte confluence, a change in the organization pattern of type III collagen in the dermal fraction of the skin equivalent was also noticed. Our comparative results show that seeding of epidermal cells on a more mature dermal equivalent leads to improved differentiation status of the epidermallayer.Des méthodes histologiques et d'immunofluorescence ont été utilisées pour analyser la présence de fibronectine, chondroïtine-4-sulphate et chondroïtine-6-sulphate, collagènes de types III et IV, laminine et de kératine afin d'évaluer la maturation d'équivalents dermiques et cutanés. En premier lieu, les fibrobiastes cultivés en monocouche ont été comparés à des équivalents dermiques où les fibrobiastes étaient incorporés dans un gel de collagène de type I. Les aspects de fluorescence étaient variables selon le système de culture utilisé. De plus, une apparition séquentielle des macromolécules a été observée dans les dermes équivalents. La fibronectine est apparue après 4 jours tandis que la chondroïtine-4-sulphate et chondroïtine-6-sulphate et le collagène de type III ont été observés après 7 jours de culture. Par contre, les trois macromolécules étaient présentes après 24 h de culture dans les fibroblastes cultivés en monocouche. En second lieu, la qualité des équivalents cutanés a été évaluée en fonction du temps de culture des équivalents dermiques (1, 4 ou 7 jours), précédant le dépôt des kératinocytes en surface. L'ensemencement des kératinocytes après 4 ou 7 jours de culture des équivalents dermiques a produit un épithélium continu et stratifié. La laminine et la fibronectine ont été détectées à la jonction dermo-épidermique mais le collagène de type IV était absent. La couche épidermique contenait différentes kératines mises en évidence par les anticorps AE1, AE2 et AE3. Un changement dans l'organisation du coilagène de type III dans la partie dermique de l'équivalent cutané a été noté après que les kératinocytes eurent atteint la confluence. En conclusion, la différenciation de la couche épidermique de l'équivalent cutané est améliorée lorsque les kératinocytes sont ensemencées sur un derme équivalent plus mature