Développement d'une thérapie génique pour l'Ataxie de Friedreich en induisant l'expression du gène de la frataxine avec les TALEs-FT

L’ataxie de Friedreich (FRDA) est la plus fréquente des ataxies héréditaires autosomiques récessives. FRDA est due à une mutation du gène de la frataxine (FXN) situé sur le chromosome 9, q13. Cette mutation est une augmentation du nombre de répétitions du trinucléotide GAA au niveau du 1er intron du gène de la frataxine (FXN). Le nombre de trinucléotides augmente de moins 30 chez les sujets normaux jusqu’à 1300 chez les patients. Cela a pour conséquence de diminuer l’expression de la protéine frataxine, une protéine qui joue un rôle important dans le métabolisme du fer dans la mitochondrie. Monprojet traite de l’utilisation des protéines TALE-platinum (plTALE) fusionnées avec des systèmes permettant une stimulation de la transcription(FT), tel que VP64 ou P300. Ces plTALEs ciblent spécifiquement la région régulatrice du gène FXN pour augmenter sa transcription et ainsi induire une augmentation de l’expression de la protéine frataxine. Les plTALEs contiennent des variations au niveau des acides aminés 4 et 30 pour chaque RVD (Repeat Variable Di-residues) en plus des variations des acides aminés 12 et 13. Ces variations permettent d’augmenter la spécificité des plTALEs pour les séquences nucléotidiques ciblées. L’assemblage des RVD de plTALEs a été fait par 4-modules RVD ce qui permet d’obtenir un rendement d’assemblage de 100%. Nous avons produit 34 effecteurs plTALE-FT qui ciblent 14 séquences du gène FXN afin, de sélectionner 3 plTALE-VP64 et 2 plTALE-SunTag10X qui peuvent augmenter la transcription et l’expression du gène FXN de 2 fois jusqu’à 19 fois dans les différentes cellules modèles FRDA. Nous avons quantifié le taux de synthèse des ARNm et de la protéine FXN après le traitement in vitroavecces plTALEs-FT par qRT-PCR et westerns. Les résultats montrent que ces plTALES-FT sélectionnés induisent l’activité transcriptionnelle du gène endogène FXN, ainsi que l’expression de la protéine frataxine in vitro. L’augmentation de la frataxine augmente l’activité d’aconitase qui est modulée réversiblement par le niveau de la frataxine dans la mitochondrie. Nous avons utilisé un virus AAV9 pour livrer plTALE-FT dans les souris modèles de FRDA dans le but de valider l’efficacité de ces effecteurs in vivoavant de passer aux tests précliniques. Les résultats de ces traitements in vivo ne sont pas encore disponibles.Friedreich's ataxia (FRDA) is the most frequent autosomal recessive hereditary ataxia. FRDA is due to a mutation of the frataxin gene (FXN) located on chromosome 9, q13. This mutation is an increase in the number of repetitions of the trinucleotide GAA in the 1st intron of the frataxine gene (FXN). The number of trinucleotides increases from less than 30 in normal subjects up to 1300 in patients. This decreases the expression of the protein frataxin, a protein which plays an important role in the metabolism of iron in the mitochondria. My project deals with the use of TALE-platinum (plTALE) proteins fused with transcription-enhancing systems (FT), such as VP64 or P300. These plTALEs specifically target the regulatory region of the FXN gene to increase its transcription and thusinduce an increase in the expression of the frataxin protein.The plTALEs contain variations in amino acids 4 and 30 for each Repeat Variable Diresidues in addition to the variations of amino acids 12 and 13. These variations make it possible to increase the specificity of the plTALEs for the targeted nucleotide sequences. The assembly of the RVDs of plTALEs was done using modules containing 4 RVDs, which makes it possible to obtain anassembly efficiency of 100%. We produced 34 plTALE-FT effectors that target 14 sequences of the FXN gene to select 3 plTALE-VP64 and 2 plTALE-SunTag10X, which increased FXN gene transcription and expression by up to 19-folds in different FRDA model cells. We quantified the synthesis of mRNAs and of FXN protein after in vitro treatment with these plTALEs-FT by qRT-PCR and westerns. The results show that these selected PlTAL-FT induced the transcription of the endogenous FXN gene as well as the expression of the frataxin protein in vitro. The increase in frataxin increased the aconitase activity, which is modulated reversibly by the level of frataxin in the mitochondria. We used an AAV9 virus to deliver plTALE-FT in FRDA model mice to validate the efficacy of these effectors in vivobefore proceeding to preclinical testing. The results of these in vivotreatments are not yet available