Generation and characterization of human T cell receptors with optimal affinity against human tumor antigens using transgenic mice

Administration of autologous chimeric antigen receptor engineered T cells to target CD19 on the surface of cancer cells have resulted in remarkable response rates in patients with relapsed B cell acute lymphoblastic leukemia. Responses in solid tumors have been less impressive, partially because of a lack of suitable target antigens. Engineering with an exogenous T cell receptor (TCR) can retarget T cells to any antigen, including intracellular ones, for which therapeutic TCRs are available. However, T cells recognizing tumor associated self-antigens in patients have TCRs with low affinity, because tolerance mechanisms select against high-affinity TCRs. Existing technologies to generate therapeutic TCRs have limitations. Murine TCRs derived from human leukocyte antigen (HLA) transgenic animals often have also low affinity and require further in vitro mutagenesis to mediate therapeutic effects. Importantly, affinity enhancement by in vitro mutagenesis of human or mouse TCRs carries the risk of losing TCR specificity and the optimal TCR affinity range is not known. To overcome current limitations, this work uses antigen-negative humanized (ABabDII) mice to generate therapeutic TCRs against an HLA-A2 presented epitope derived from the cancer/testis antigen MAGE-A1. ABabDII mice provide a diverse human TCR repertoire but are not tolerant to most human tumor associated self-antigens, including MAGE-A1. Cancer/testis antigens are expressed in developing germ cells and during embryonic development but are silenced in normal adult human tissues. They become reactivated during cancer progression in several malignancies as a consequence of promoter hypomethylation, making them preferential targets among tumor associated self-antigens for cancer immunotherapy. Three MAGE-A1 specific TCRs are generated in ABabDII mice and compared to two TCRs isolated from healthy human donors. By comparison, ABabDII derived TCRs outperform human derived TCRs in terms of target cell lysis, IFNγ production and antigen sensitivity in vitro. In addition, in a syngeneic MAGE-A1 expressing fibrosarcoma model, T cells engineered with ABabDII derived TCRs induced tumor regression while a human derived TCR did not delay tumor growth coinciding with superior antigen-specific in vivo T cell proliferation mediated by ABabDII derived TCRs. Anticipating clinical application, one of the ABabDII derived TCRs was further characterized with respect to off-target toxicity. The ABabDII derived TCR was found to be highly specific without evidence of relevant cross-reactivity to other peptides or other HLAs. These results are compatible with functionally relevant tolerance towards MAGE-A1 in humans and establish ABabDII mice as a source for therapeutic TCRs with optimal affinity against human tumor antigens.Die Applikation autologer T Zellen, die mit chimären Antigenrezeptoren zur Erkennung von CD19 auf Tumorzellen modifiziert wurden, führte zu erstaunlichen Ansprechraten bei Patienten mit rezidivierter akuter B-lymphoblastischer Leukämie. Die mit modifizierten T Zellen in soliden Tumoren erzielten Ansprechraten sind deutlich geringer, teilweise aufgrund des Fehlens geeigneter Zielantigene. Durch Modifikation mit einem neuen T-Zell-Rezeptor (TCR) ist es möglich, T-Zellen mit Reaktivität gegen beliebige, auch intrazelluläre, Antigene zu generieren, sofern geeignete TCRs zur Verfügung stehen. Gegen tumorassoziierte Selbstantigene gerichtete TCRs haben jedoch meist suboptimale Affinität für ihr Zielantigen, da T Zellen mit hoch-affinen TCRs gegen Selbstantigene im Thymus eliminiert werden. Aktuell verwendete Technologien zur Generierung von therapeutischen TCRs haben Nachteile. Murine TCRs aus humanen Leukozytenantigen (HLA) transgenen Mäusen haben häufig auch eine niedrige Affinität für das Zielantigen und erfordern weitere in vitro Mutagenese für therapeutische Effektivität. In vitro Mutagenese birgt jedoch generell das Risiko des Verlustes der TCR-Spezifität. Zusätzlich ist die optimale TCR-Affinität nicht bekannt. In dieser Arbeit wurden TCRs gegen ein HLA-A2-präsentiertes Epitop des Cancer/Testis-Antigens MAGE-A1 in Antigen-negativen humanisierten (ABabDII) Mäusen generiert. ABabDII Mäuse besitzen T Zellen mit einem diversen, humanen TCR Repertoire, sind jedoch nicht tolerant gegenüber den meisten humanen Tumorantigenen. Cancer/Testis-Antigene werden in der Gametogenese sowie während der Embryonalentwicklung exprimiert, jedoch nicht in gesundem adulten Gewebe. Durch Promotorhypomethylierung kommt es in verschiedenen Tumorentitäten zur Reaktivierung von Cancer/Testis-Antigenen, weshalb sie bevorzugte Zielstrukturen für die Tumorimmuntherapie darstellen. Drei MAGE-A1 spezifische TCRs wurden in ABabDII-Mäusen generiert und mit zwei TCRs verglichen, die aus T-Zellen von gesunden humanen Spendern isoliert wurden. Die TCRs aus ABabDII Mäusen zeigten eine höhere Zytotoxizität und IFNγ-Sekretion nach Stimulation mit MAGE-A1 positiven Tumorzellen sowie eine höhere Antigensensitivität. Zusätzlich induzierten T-Zellen mit TCRs aus ABabDII Mäusen Tumorregression in einem syngenen MAGE-A1 positiven Fibrosarkommodell, während T-Zellen mit TCRs aus dem humanen System keinen Einfluss auf das Tumorwachstum hatten. Die Antitumoraktivität der ABabDII TCRs ging mit einer deutlich besseren antigenspezifischen in vivo Proliferation der modifizierten T Zellen einher. In Vorbereitung auf eine klinische Anwendung wurde einer der aus ABabDII Mäusen isolierten TCRs weitergehend hinsichtlich des Risikos für „off-target“ Toxizität charakterisiert. Für den untersuchten TCR zeigten sich keine Hinweise auf Kreuzreaktivität gegenüber anderen Peptidantigenen oder anderen HLAs. Diese Ergebnisse sprechen für funktionell relevante Toleranz gegenüber MAGE-A1 und etablieren ABabDII Mäuse als System zur Generierung therapeutischer TCRs mit optimaler Affinität gegenüber humanen Tumorantigenen