Characterization of the genetic and epigenetic profile of tongue squamous cell carcinoma

Dissertação de Mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraO carcinoma epidermóide da língua é uma neoplasia invasiva, caracterizada por metástases precoces e extensivas dos gânglios linfáticos, o que contribui para a agressividade destes tumores. A sua incidência tem vindo a aumentar mundialmente, sendo o tumor maligno mais comum da cavidade oral. O risco de doentes diagnosticados com cancro da língua virem a desenvolver uma recidiva é superior ao dos diagnosticados com qualquer outro subtipo de cancro da cabeça e pescoço. De acordo com o sistema de classificação TNM (Tumor-Nodes-Metastasis), doentes em estadios mais iniciais da doença teoricamente deveriam apresentar um prognóstico mais favorável. Porém, estes doentes, contrariamente ao antecipado, apresentam um prognóstico menos favorável quando comparados com doentes em estadios mais avançados de outros subtipos de carcinomas da cabeça e pescoço. Isto revela que o presente sistema de classificação não é o mais adequado para um prognóstico correcto dos doentes com cancro da língua. Diferenças na evolução clínica dos doentes que varia de acordo com a localização anatómica do tumor, sugere a possibilidade de os mecanismos moleculares envolvidos no processo carcinogéneo dos diferentes tipos de cancro da cabeça e pescoço serem também eles distintos. Por este motivo é importante estudar a língua como uma localização anatómica isolada, de forma a identificar as principais alterações moleculares específicas envolvidas no desenvolvimento e progressão do carcinoma epidermóide da língua. O principal objectivo do presente estudo foi a caracterização do perfil genético e epigenético de 31 carcinomas primários da língua, obtidos aquando remoção cirúrgica, através da técnica de MS-MLPA (Methylation-specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). As alterações mais frequentes foram detectadas nos genes WT1, PAX5, GATA5, MSH6, PYCARD, STK11, CDKN2A, CHFR, BRCA1, GSTP1, TP53, RARB e CADM1, sugerindo a importância destes genes no processo carcinogéneo. A metilação do gene MSH6 poderá estar associada a estadios mais avançados da doença e ao desenvolvimento de metástases. O presente estudo revelou diferentes alterações genéticas e epigenéticas que poderão estar envolvidas no desenvolvimento e progressão do carcinoma da língua, estabelecendo-se em paralelo uma associação com as características clínicas e patológicas dos doentes. Os genes identificados servem de base para estudos futuros com uma maior amostragem, de forma a estabelecer uma associação estatisticamente significativa entre genótipo e fenótipo. A identificação de biomarcadores irá permitir um diagnóstico cada vez mais precoce, uma avaliação assertiva do prognóstico e subdividir os doentes de acordo com o seu perfil genómico e clínico, de forma a prever mais eficazmente a sua evolução clínica e qual o melhor tratamento a seguir. O desenvolvimento e optimização de metodologias que permitem a extracção de DNA genómico pouco fragmentado e em elevada quantidade e pureza a partir de amostras de tecido parafinizado é essencial para um aumento da amostragem utilizada em estudos genéticos. O presente trabalho permitiu também optimizar e estabelecer um método eficiente e reprodutível de extracção de DNA a partir de amostras de tecido incluído em parafina de carcinomas da língua, obtendo-se concentrações relativamente elevadas de DNA, com elevada pureza.Tongue squamous cell carcinoma (TSCC) is the most common malignancy in the oral cavity, characterized by high recurrence rates, reduced overall survival and increasing incidence worldwide. A higher risk of locoregional failure is observed in these carcinomas as compared with other head and neck subsites, contributing to the invasiveness and aggressiveness of these tumors. Applying the Tumor, Nodes and Metastasis (TNM) classification system, patients with early stage TSCC would theoretically represent those with better prognosis. However, this group of patients has the worse prognosis as compared with other head and neck subsites with more advanced stage disease, revealing that the current clinicopathological criteria does not comprehensively differentiate patient prognosis. The discrepancy in patients’ outcome according to the anatomical subsites of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) highlights the presence of different molecular mechanisms underlying tumorigenesis. For this reason, further investigation specifically at the tongue subsite would be of benefit to determine subsite-specific molecular drivers of carcinogenesis in a single and relatively homogeneous site. The main objective of the present thesis was the characterization of the genetic and epigenetic profile by Methylation-specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA) technique of 31 primary tongue tumors, collected from patients with TSCC, upon resection surgery. The most frequently altered genes in the present cohort were WT1, PAX5, GATA5, MSH6, PYCARD, STK11, CDKN2A, CHFR, BRCA1, GSTP1, TP53, RARB and CADM1, suggesting the important role of the present genes in the development and progression of TSCC. Methylation of MSH6 gene seemed to be associated with more advanced stages of the disease and metastasis. The present study revealed several genetic and epigenetic alterations that may play a role in TSCC development in association with patient’s clinicopathological features. The highlighted genes provide a basis for further research in larger cohorts that may lead to the identification of candidate biomarkers allowing for a better diagnosis, prognosis and accurate risk-stratification of patients, as well as choose the most adequate treatment and predict treatment response in TSCC. The development of methods that allow the recovery of optimal quality DNA from formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissues is essential to increase the cohorts for cancer research. In the present study an efficient and reproducible method of DNA extraction from FFPE tongue tumor samples, yielding relatively high concentrations and high purity DNA was established