Expression and purification of Channelrhodopsin-2 in Pichia pastoris: generation of blue-shifted and redshifted optogenetic variants

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.O sistema nervoso é constituído por diferentes tipos de neurónios que comunicam entre si formando uma rede complexa. A grande heterogeneidade desta rede proporciona um desafio à compreensão dos mecanismos e conexões neuronais. Desde o nascimento da neurociência, um dos grandes objectivos, foi e continua a ser, a possibilidade de exercer um controlo preciso sobre a actividade de diferentes tipos de neurónios para melhor perceber a sua função. A optogenética fornece uma estratégia para alcançar este objectivo. O termo “optogenética” refere-se à integração dos conceitos de óptica e genética para atingir ganho de funçao e perda de funçao de eventos específicos dentro de grupos de células particulares, embutidas em tecidos vivos, heterogéneos e complexos. Um papel-chave desta nova metodologia é desempenhado pelas Channelrhodopsins. Na natureza, estas proteínas transmembranares estão presentes na alga Chlamydomonas reinhardtii, onde são responsáveis pelo comportamento fototáxico deste microrganismo. Ao contrário de outras proteínas relacionadas, como por exemplo, a Bacteriorhodopsin (BR), Halorhodopsin (HR) ou rodopsinas sensoriais (SRs), que são conhecidas já desde 1980, a mais “recente” família de opsinas, as Channelrhodopsins, só foram descobertas em 2002. A Channelrhodopsin-1 e Channelrhodopsin-2 (ChR2) são membros da família de proteínas que ligam e usam o retinal (um aldeído da Vitamina-A) como cromóforo para responder à luz. A ChR2 é um canal activado por luz, que após iluminação com luz azul, permite a passagem passiva de catiões através da membrana celular. Quando expresso em neurónios, este canal permite assim a despolarização da célula. Esta propriedade faz com que este canal seja uma importante ferramenta para a optogenética. De facto, em 2005, um grupo de investigadores, expressou a ChR2 em neurónios de mamíferos e descreveu a capacidade de controlar, na ordem dos milissegundos, a transmissão sináptica excitatória e os potenciais de acção. A partir dessa altura, estudos adicionais foram apoiando a ideia do desenvolvimento de mais proteínas activadas pela luz, como um meio de controlar a excitabilidade neuronal e a transmissão sináptica em vário modelos in vivo, desde Drosophila, até murganhos transgénicos. Estes últimos em particular validaram a possibilidade de usar estas ferramentas para o mapeamento de circuitos neuronais complexos. Apesar do sucesso das ferramentas optogenéticas, as Channelrhodopsins apresentam ainda limitações, tais como, baixas correntes e forte inativação, o que não é ideal para certas aplicações biológicas, e uma absorção que normalmente não estende para além de 520nm, o que limita a sua aplicação profunda em meios como o cérebro que exibem grande dispersão de luz. A engenharia genética foi usada para obter variantes de Channelrhodopsins com algumas melhorias. O leque de ferramentas continua a ser expandido através do suplemento de novas variantes de Channelrhodopsin obtidas por várias estratégias (tais como, mutagénese dirigida, permute de domínios entre rodopsinas de diferentes espécies, modificações no N- e no C-terminal, e pesquisas em genomas para encontrar novas rodopsinas) que podem ser combinadas para aumentar o campo de desenvolvimento de ferramentas optogenéticas. Um contributo significativo para estas ferramentas ocorreu em 2012 com a cristalização e a descoberta da estrutura da Channelrhodopsin. Isto abriu a possibilidade de compreender a estrutura da proteína e evidenciar quais os aminoácidos envolvidos na formação do poro interno do canal e os que interagem com o cromóforo – o retinal. Mutações nos aminoácidos envolvidos na interação com o cromóforo, levantam a possibilidade de induzir um efeito de deslocação para o vermelho no espectro de absorção da Channelrhodopsin, e assim reduzir a sobreposição com o espectro da proteína não-mutada. Esta estratégia permite conseguir ferramentas para um controlo preciso de redes neuronais com conexões complexas. O objectivo deste trabalho foi expressar, purificar e caracterizar novas variantes de ChR2. Começando por um estudo que prevê o efeito de mutações especificas no espectro de absorção de ChR2, foram selecionados dois mutantes da fenilalanina 269 (F269), um aminoácido muito perto da molécula de retinal. O primeiro passo foi a geração destes mutantes por mutagénese dirigida, usando primers específicos para a forma humanizada da ChR2. Após a confirmação dos resultados por sequenciação, os novos mutantes foram sub-clonados num vector para a expressão e purificação de proteínas num sistema de expressão heteróloga – a levedura Pichia pastoris. A sequência mutada foi integrada num vector contendo o promotor AOX1, que ao ser activado por metanol leva à expressão do gene de interesse. A transformação de Pichia pastoris por electroporação com o DNA de interesse originou um elevado número de transformantes. Apóa a electroporação, as células foram plaquedas em meio com concentrações crescentes de zeocina por forma a selecionar clones com múltiplos eventos de integração. As colónias selecionadas, foram depois crescidas ao longo de 24 horas em meio contendo metanol para induzir a expressão proteica. Diversos protocolos foram testados com o objectivo de maximizar a recolha de ChR2 expressa. Dentro destes, o método de “French Press” foi o que apresentou maior eficiência. Finalmente foi também optimizado o sistema de purificação de proteína por cromatografia e a detecção proteica em gel pelo método do coloração com prata.The nervous system consists in a complex network of interconnected cells. Its great heterogeneity provides a challenge for a deeper understanding of the neural mechanism and the connection in the brain. Since the birth of neuroscience, a main goal was, and still is, the possibility of having a precise control of the activity of specific types of neuron and to dissect their function. Optogenetics provides a good strategy to reach this purpose. The term “optogenetics” refers to the integration of optics and genetics to obtain gain or loss of function in well-defined events within specific cells in living tissue. A key role in the improvement of this new technique is played by Channelrhodopsins. These are transmembrane protein channels, naturally expressed in the algae Chlamydomonas reinhardtii, and are responsible for the phototaxis behavior in this microorganism. Unlike their “close relatives” Bacteriorhodopsin (BR), Halorhodopsin (HR) and Sensory rhodopsins (SRs), already known since the 1980s, the “latest” of the opsin family, Channelrhodopsins (ChRs), were discovered in 2002. Channelrhodopsin-1 and Channelrhodopsin-2 are members of the retylinidene family of proteins and, as all the protein belonging to this class, use retinal, a vitamin-A aldehyde, as chromophore to respond to light. Channelrhodopsin-2 is a blue-light activated channel that after illumination triggers a passive cationic conductance through the membrane. If expressed in neurons, the channel permits the depolarization of cell. This property makes this channel a very useful optogenetic tool. In fact, in 2005 a group of researchers, expressing ChR2 in mammalian neurons, described a reliable, millisecondtime scale control of neuronal spiking and excitatory synaptic transmission. From this point, additional studies supported the idea of developing light-activated signaling proteins to control neuronal excitability and modulate synaptic transmission in vivo models, from Drosophila to ultimately transgenic mice. These applications validate the power of ChR2 as an innovative tool to perform precise control over neuronal spiking and synaptic transmission and to have the possibility of mapping complex neural circuits. Despite this success as optogenetic tools, Channelrhodopsins still present some limitations. Small currents and strong inactivation properties are not ideal for some biological applications. Furthermore, an absorption spectra not normally extendible over 520 nm limits their use in high light-scattering environment such as the brain. Nevertheless, genetic engineering has been used to obtain Channelrhodopsin variants with improved features. This array of tools is continually expanded through the addition of new Channelrhodopsin variants obtained by various strategies (site-directed mutagenesis, domain swapping between different Channelrhodopsin species, modification of N-termini and C-termini or genome mining to find new sequences) that can be combined to enhance the field of optogenetic tool development. A great contribute to the improvement of these tool came in 2012 with the publication of the crystal structure of Channelrhodopsin. This opened the possibility of a better comprehension of the protein structure, evidencing the amino acid residues involved in the formation of the inner pore, those responsible for the gating of the channel, and the amino acids that interact with the retinal, in the chromophore pocket. It seems that specific amino acid are involved in the interactions with the chromophore and that mutations of these amino acids may lead to the possibility of a shift in the absorption spectra of the channel, in order to reduce the overlapping of the wavelengths and to obtain a more precise control in the complex network of neural connections. The aim of this work was to express, purify and characterize novel mutated variants of ChR2. Starting from a predictive study of mutations, we selected two mutants of the phenylalanine 269 (F269), an amino acid residue very close to the retinal binding pocket. The first step was to perform a directed mutagenesis, using specific primers designed to induce the desired mutations in a humanized ChR2 sequence. After confirming the result through sequencing, we performed a ligation to subclone our novel mutants in a vector for the expression and purification of the proteins in the yeast Pichia pastoris. The mutated sequence was then integrated in frame with the promotor AOX1, which when activated by methanol induces the expression of our gene of interest. We transformed the yeast with our mutated DNA through electroporation, yielding a high rate of transformants. After transformation, we plated the cells on Zeocin plates with varying levels of antibiotic concentration to select clones with multiple copy integration. The selected colonies were then grown in a liquid media with methanol for 24 hours, to induce the expression of the protein. Different methods of protein extraction were tested in order to establish which one displayed most efficient extraction. We found that the French press yields the highest efficiency in protein recovery. Finally we optimized the purification of the protein in a chromatography system and assess purity through silver staining.IF/00812/2012Pest-C/SAU/LA0001/2013-2014PCIG13-GA-2013-61852