Unveiling the role of adenosine A2A receptors on neurogenesis induced by activation of cannabinoid receptors in rat SVZ and DG stem/progenitor cell cultures

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.A ideia de que neurogénese, o processo pelo qual são produzidos novos neurónios funcionais, não ocorre no cérebro adulto foi alterada consideravelmente ao longo dos anos. Efetivamente, a neurogénese ocorre em dois nichos neurogénicos distintos, a zona subventricular (SVZ), que percorre a parede lateral dos ventrículos laterais, e a zona subgranular (SGZ, no giro dentado (DG) do hipocampo, onde neurónios recém-formados, descendentes de células estaminais/progenitoras neurais, apresentam papéis no olfato/discriminação de odores e em aprendizagem/memória, respetivamente. A adenosina, um neuro-modulador amplamente presente no cérebro, tem um papel preponderante na transmissão sináptica e está envolvida na regulação de muito processos fisiológicos e neuropatológicos. O sistema endocanabinóide, onde são principalmente ativados os recetores de canabinóides do tipo 1 e 2 (CB1R e CB2R), é um regulador-chave da função sináptica, especialmente pela inibição da libertação de neurotransmissores. Além disso, processos essenciais na neurogénese como proliferação, diferenciação e maturação neuronal são modulados pela ativação de recetores de canabinóides. Importantemente, foi demonstrada a interação os entre recetores A2A de adenosina (A2ARs) e CB1Rs que é especialmente importante no controlo da função neuronal e transmissão sináptica. Contudo, até à data, nenhum estudo avaliou diretamente os efeitos desta possível interação entre os recetores A2A de adenosina e recetores de canabinóides na neurogénese. Assim, neste trabalho, foi investigado o possível papel dos A2ARs na neurogénese induzida pela ativação dos recetores CB1Rs e CB2Rs, olhando para diferentes estádios do processo neurogénico. Os resultados mostram que ativação dos A2ARs, CB1Rs ou CB2Rs não altera a divisão celular no sentido de promover um aumento ou diminuição da capacidade de auto-renovação na SVZ. Além disso, ativação dos A2ARs e CB2Rs não promove proliferação das células SVZ. Contudo, a ativação dos CB1Rs promove um aumento na proliferação das células SVZ, um efeito bloqueado pela presença de um antagonista dos A2ARs. Interessantemente, a ativação de ambos CB1Rs ou CB2R induz um aumento na diferenciação neuronal das células SVZ e este efeito é comprometido pelo bloqueio dos A2ARs, apesar de per se a ativação dos A2ARs não ter nenhum efeito na diferenciação neuronal. Em relação ao nicho neurogénico DG, foi observado que, apesar da ativação dos CB1Rs não promover nenhum efeito no destino celular das células derivadas do DG, ativação dos CB2R e A2ARs promove a perpetuação do pool estaminal das células de DG. O efeito promovido pelos CB2R é bloqueado pela presença de antagonista seletivo de A2ARs e semelhantemente, o efeito promovido pelos A2ARs é bloqueado pela presença de antagonistas seletivos para CB1R ou CB2R. Adicionalmente, apesar da ativação dos CB1Rs, 14 CB2Rs ou A2ARs per se não produzir qualquer efeito na proliferação das células DG, um aumento no número de células em proliferação é visto quando há co-ativação de CB1Rs ou CB2Rs com A2ARs. Por fim, a ativação dos CB1Rs, CB2Rs e A2ARs promove um aumento na diferenciação neuronal das células DG. Interessantemente, o efeito promovido pelos CB1R ou CB2R é bloqueado pela presença de um antagonista seletivo dos A2ARs assim como o efeito mediado pelos A2ARs é bloqueado pela presença de antagonistas seletivos para CB1R ou CB2R. Em resumo, os resultados levam a acreditar que possa existir uma interação entre os sistemas adenosinérgico e endocanabinóide, provavelmente a nível estrutural (com a formação de heterómeros) ou interação ao nível das vias de sinalização, o que contribuirá em última instância para o controlo da neurogénese.Over the past years, the idea that neurogenesis, the process by which new functional neurons are produced, does not occur in the adult matured brain has considerably changed. In fact, neurogenesis actively occurs mainly in two distinct neurogenic niches, the subventricular zone (SVZ), along the lateral walls of the lateral ventricles, and the subgranular zone (SGZ), in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus, where newly formed neurons, derived from neural stem/progenitor cells (NSPCs), have a role in olfaction/odor discrimination and in learning/memory, respectively. Adenosine, which is a widespread neuromodulator in the brain, greatly influences synaptic neurotransmission and is involved in many physiological and neuropathological processes. Moreover, the endocannabinoid system, which activates primarily type 1 and 2 cannabinoid receptors (CB1R and CB2R), is a key regulator of synaptic function, especially by inhibiting neurotransmitter release. Furthermore, it has been shown that CB1R and CB2R activation modulates neurogenesis by promoting neural stem cell proliferation, differentiation and maturation. Importantly, an interaction between A2A receptors (A2ARs) and CB1Rs was reported and shown to allow the control of key modulatory effects on neuronal function and transmission. However, to date, no study has directly evaluated the effects of the crosstalk between A2ARs and CBRs on neurogenesis. Therefore, in this work, the putative role of A2ARs on neurogenesis induced by the activation of CB1Rs and CB2Rs was investigated by looking at different stages of the neurogenic process. Results show that CB1R, CB2R or A2AR activation did not change the SVZ cell-fate. Moreover, activation of CB2R or A2AR did not induce SVZ cell proliferation. However, CB1R activation promoted cell proliferation, an effect that was blocked by an A2AR selective antagonist. Interestingly, activation of either CB1R or CB2R promoted an increase in SVZ neuronal differentiation that is impaired by A2AR blockade, although A2AR activation per se had no effect on neuronal differentiation. Concerning the DG neurogenic niche it was observed that while CB1R activation had no effect on the cell fate of DG cells, activation of CB2Rs or A2ARs promoted self-renewing divisions. Furthermore, A2AR selective antagonist blocked the effect mediated by activation of CB2Rs in the self-renewal of DG cells. Moreover, A2AR-mediated effect on self-renewal was blocked either by CB1R or CB2R selective antagonists. Moreover, although activation of CB1R, CB2R or A2AR per se did not induce DG cell proliferation, an increase in the number of proliferating cells was observed upon CB1R or CB2R co-activation with A2ARs. Lastly, CB1R, CB2R and A2AR activation promoted DG neuronal differentiation. Interestingly, the effect 12 mediated by CB1Rs or CB2Rs was blocked by an A2AR selective antagonist, while the effect mediated by A2ARs was impaired in the presence of CB1R or CB2R selective antagonists. Taken together, these results suggest that a possible crosstalk between the adenosinergic and endocannabinoid systems may exist, either by a structural interaction (formation of heterodimers) or by crosstalk at downstream signaling, that ultimately contributes to the control of neurogenesis