Natural killer cell-based immunotherapy: a new approach for targeting cancer stem cells in bladder cancer

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraO carcinoma da bexiga (CB) é a neoplasia maligna mais comum do trato urinário, sendo o 4º tipo de carcinoma mais comum nos homens e o 9º nas mulheres, no mundo ocidental. Na maioria dos casos os tumores são classificados como não músculo-invasivos, e são tratados por resseção transuretral e terapia intravesical. No entanto, cerca de 80% dos doentes apresenta propensão para recidivas e progressão para formas músculo-invasivas, geralmente refratárias à terapêutica. Apesar de já identificados alguns fatores de risco, ainda não estão bem estabelecidos os fatores preditivos da recidiva e progressão da doença. Estudos recentes associam a elevada taxa de recidivas e a baixa sobrevida à presença de células indiferenciadas com caraterísticas estaminais, denominadas de células estaminais cancerígenas (CSCs), com capacidade de autorrenovação e potencial tumorigénico. Uma eliminação efetiva das CSCs em fases iniciais da doença pode reduzir o risco de recidivas e progressão tumoral para estadios mais invasivos. Atualmente, as terapêuticas em vigor não conseguem eliminar as CSCs podendo até favorecer a seleção de clones resistentes e a sua expansão por autorrenovação. Esta tese teve como principal objetivo avaliar o potencial da aplicação de uma nova abordagem terapêutica baseada na imunoterapia adotiva com células Natural Killer (NK) na eliminação das CSCs no CB e o seu impacto na progressão tumoral. Numa primeira fase, demonstrámos que o CB do tipo músculo-invasivo contém uma população heterogénea de CSCs caraterizada pela expressão de fatores de pluripotência, de marcadores de células estaminais da camada basal do urotélio e de sistemas de desintoxicação de fármacos. Estas células apresentam ainda elevada resistência à cisplatina e ao metotrexato, e formam tumores heterogéneos com uma histologia semelhante à do carcinoma músculo-invasivo quando inoculadas por via ortotópica em ratinhos imunodeprimidos. Identificámos ainda uma potencial assinatura molecular definida pela expressão do SOX2 e da ALDH2, validada a nível proteico em secções de tecido tumoral, e que poderá ser útil na identificação de doentes com tumores músculo-invasivos mais propensos a evoluir para formas mais agressivas. A expressão preferencial de pelo menos dois marcadores de estaminalidade nos tumores músculo-invasivos reforça o papel das CSCs como a força motriz da sua patogénese e recidivas, destacando a necessidade de delinear novas abordagens terapêuticas tendo como alvo as CSCs. De seguida, avaliámos o potencial terapêutico da imunoterapia adotiva com células NK na eliminação das CSCs resistentes à quimioterapia. Verificámos que células NK isoladas de dadores saudáveis e ativadas com IL-2/IL-15 são eficazes na indução de uma resposta antitumoral contra as células do CB através da produção de TNF-α, IFN-γ e granzima B. Contrariamente à quimioterapia, as células NK ativadas demonstraram um elevado potencial citotóxico tanto para as células parentais como para as CSCs. Este efeito é sobretudo mediado pela sobreexpressão de ligandos à superfície das células alvo para os recetores ativadores, NKG2D e DNAM-1 nas NK. Adicionalmente, as células NK induziram uma alteração no fenótipo das CSCs para um estado mais diferenciado, acompanhada de uma diminuição da expressão dos marcadores de estaminalidade. Este efeito aumentou a sensibilidade das CSCs ao efeito da cisplatina, realçando os benefícios de uma possível terapêutica combinada. Pelo contrário, as células NK de doentes com CB exibiram uma expressão diminuída de recetores de citotoxicidade, de moléculas de adesão e apresentaram um fenótipo mais imaturo, sendo ineficazes na eliminação direta das CSCs bem como na indução da sua diferenciação. Os estudos in vivo comprovaram a elevada eficácia terapêutica das células NK isoladas de dadores saudáveis, em dois modelos animais de CB. A injeção intratumoral de células NK, no modelo subcutâneo, conduziu a uma remissão completa do tumor sem evidência de recidiva. Isto é consistente com a capacidade das células NK em eliminar tanto as CSCs como as células mais diferenciadas que constituem maioritariamente o tumor. No modelo ortotópico, a administração intravesical de células NK resultou numa diminuição massiva do tumor, entre 80 a 100% (remissão total), o que indica que as células NK mantêm a sua capacidade lítica no microambiente tumoral. Em conclusão, os nossos resultados demonstram a existência de subpopulações heterogéneas de CSCs no CB com elevado potencial tumorigénico e resistentes à quimioterapia convencional, mas extremamente suscetíveis à atividade lítica de células NK alogeneicas ativadas. Uma vez que as células NK são igualmente eficazes na eliminação das CSCs e das células mais diferenciadas, a sua administração intravesical poderá ser considerada como uma promissora estratégia para o tratamento dos doentes com CB, per se ou de forma complementar às opções terapêuticas atuais.Bladder cancer (BC) is the most common malignancy of the urinary tract. It is the 4th most common cancer among men and the 9th in women in Western world. The majority of newly diagnosed cases are non-muscle-invasive tumors and can be effectively treated by transurethral resection and intravesical therapy. However, approximately 80% of patients have high propensity for tumor recurrence and to progress into muscle-invasive forms, being largely refractory to conventional therapy. Although some risk factors have been associated with disease appearance and progression, no concrete indicators are firmly established that can reliably predict its evolution and prognosis. Striking evidence associates the high recurrence rates and poor survival of BC patients to the presence of a distinct undifferentiated stem-like cell population, the so-called cancer stem cells (CSCs) endowed with extensive self-renewal and tumorigenic potential. An effective eradication of CSC in an early-stage is likely to reduce the risk of recurrences and the progression to a more invasive disease. Presently, current therapies mostly fail to eradicate CSC clones and instead may even favor expansion of the CSC pool and/or select resistant self-renewing clones. The main goal of this thesis was to evaluate the potential application of a novel therapeutic approach using Natural Killer (NK)-based adoptive immunotherapy in the eradication of competent CSCs and its impact on tumor progression. In the first part, we demonstrated that muscle-invasive BC harbor distinct cell subsets reflecting molecular features of stem-like cells, namely a gene expression pattern strongly related with stem cell pluripotency, basal urothelial stem cells and drug-detoxifying systems. Moreover, these cells displayed enhanced chemoresistance to cisplatin and methotrexate and formed a phenotypically heterogeneous tumor resembling the histological features of primary invasive BC when engrafted orthotopically in the bladder of immunocompromised mice. Based on a real time PCR analysis we identified a potential molecular signature defined by SOX2 and ALDH2, validated at protein level in tumor tissue sections, which could be useful on the recognition of patients with muscle-invasive tumors that are more prone to experience disease progression. The preferential expression of at least two stemness-related markers in muscle-invasive tumors strongly reinforces the role of CSCs as a driving force in the pathogenesis and relapse of invasive BC, highlighting the need to delineate novel therapeutic approaches considering CSCs as a target population. In the second part, we evaluated the therapeutic potential of NK cells based-immunotherapy against the chemoresistant bladder CSCs. We found out that NK cells isolated from healthy donors and activated with IL-2/IL-15 were highly effective in mediating an anti-tumor response by production of TNF-α, IFN-γ and granzyme B towards BC cells. Importantly, unlike chemotherapy, activated NK cells demonstrated enhanced cytolytic potential against both parental and bladder CSCs through an increased expression of ligands for NKG2D and DNAM-1 NK-activating receptors on the surface of BC cells. Besides the cytolytic/cytotoxic potential, NK cells were able to induce a phenotypic switching of the CSCs towards a more differentiated state and a concomitant down regulation of stemness-related markers. This NK-induced differentiation effect sensitized CSCs to cisplatin, highlighting the benefits of a possible combined therapy. In opposite, NK cells from BC patients displayed low density of NK cytotoxicity receptors, adhesion molecules and a more immature phenotype, and were ineffective in killing and inducing differentiation of CSCs. Conveying to an in vivo context, our results showed a remarkable and noteworthy anti-tumor effect of healthy activated-NK cells in BC xenografted models. The intratumoral delivery of activated-NK cells in subcutaneous tumors leads to a complete abolishment of tumor growth with no evidence of recurrence, consistent with the ability of NK cells to kill CSCs and non-CSCs populations. In the orthotopic model, the intravesical administration of NK cells resulted in a massive decrease in the tumor burden, ranging from 80 to 100% (complete remission), indicating that NK cells maintain their intrinsic killing ability in an in vivo tumor microenvironment. In conclusion, our results provide compelling evidence that BC harbors distinct CSCs populations that are highly tumorigenic and resistant to conventional chemotherapy but extremely susceptible to allogeneic activated-NK cells. Moreover, since NK cells targets both stem and non-stem cell populations and promotes CSCs differentiation, NK cells intravesical immunotherapy might be considered as a promising alternative or complementary therapeutic strategy for BC patients