Desenvolvimento de microelétrodos de fibra de carbono para a medição de dopamina no cérebro

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraA dopamina é um dos neurotransmissores do grupo das catecolaminas mais estudados pelo facto de estar envolvida em vários processos neuronais fisiológicos tais como o desenvolvimento motor, o controlo dos movimentos, a recompensa, a memória, e a perceção. Adicionalmente, desempenha um papel relevante em certas patologias, como nas doenças de Parkinson e Huntington, na esquizofrenia e na adição. Como tal, a medição da dopamina in vivo ou ex vivo no cérebro é bastante importante para a compreensão do funcionamento dos circuitos dopaminérgicos. A microdiálise e as técnicas eletroquímicas têm sido bastante utilizadas para medir a dopamina no cérebro. O recurso a técnicas eletroquímicas rápidas é particularmente atrativo porque confere uma elevada resolução temporal e espacial, e ainda uma elevada sensibilidade e seletividade. Baseiam-se na utilização de microelétrodos de que são exemplo os microelétrodos de fibra de carbono, beneficiando das suas dimensões micrométricas, das excelentes propriedades eletroquímicas e da sua biocompatibilidade. No presente trabalho fabricaram-se microelétrodos de fibra de carbono de 7 e de 30μm de diâmetro (CFM7 e CFM30, respetivamente). A superfície eletroquimicamente ativa dos microelétrodos foi revestida com duas e quatro camadas de Nafion® (5%) ou com um filme compósito de nanotubos de carbono de parede simples suspensos em Nafion® (5%). Foi feita uma avaliação das propriedades analíticas dos microelétrodos através da utilização de técnicas eletroquímicas (e.g. voltametria cíclica, voltametria de onda quadrada e amperometria), nomeadamente da sensibilidade, seletividade, limite de deteção (LOD) e tempo de resposta. Adicionalmente, foi efetuado o estudo eletroquímico da dopamina, designadamente dos potenciais de oxidação e redução e a avaliação dos efeitos do pH e da velocidade de varrimento sobre os mesmos, tendo como objetivo compreender o mecanismo da reação redox. Por voltametria cíclica comprovou-se que a dopamina tem um comportamento eletroquímico quasi-reversível, em que a reação de oxidação é controlada por adsorção e difusão a baixas (100mV/s) velocidades de varrimento, respetivamente. O potencial de oxidação diminuiu com o pH -56mV/pH e - 69mV/pH para os CFM30 e os CFM7, respetivamente. Estes resultados indicam que o mecanismo de reação envolve uma reação eletroquímica da dopamina seguida por uma reação química do seu produto de oxidação (mecanismo EC). Pela utilização da voltametria de onda quadrada verificou-se um potencial de pico de oxidação de +0,2V vs. Ag/AgCl. Adicionalmente, foi observado que a relação entre a corrente de pico e a concentração de Resumo iv dopamina se afasta da linearidade para concentrações ≥2μM, o que pode estar relacionado com a adsorção dos produtos de oxidação à superfície dos microelétrodos. Os dois tipos de microelétrodos CFM30 e CFM7 foram avaliados por amperometria e num sistema de análise por injeção de fluxo (FIA) ao nível da sensibilidade, limite de deteção, seletividade e tempo de resposta. Quando comparados com os microelétrodos em bare, o revestimento com duas e quatro camadas de Nafion® (5%) diminuiu ligeiramente a sensibilidade e aumentou o LOD (p>0,05). Como era esperado, o Nafion® aumentou significativamente a seletividade dos microelétrodos e o tempo de resposta, o que está de acordo com publicações anteriores. Ademais, a sensibilidade e o LOD não foram melhorados com o revestimento dos dois tipos de microelétrodos com o filme compósito de nanotubos de carbono de parede simples em Nafion® (5%). No entanto, a seletividade aumentou significativamente (p<0,05) ainda que em menor escala quando comparada com os CFMs revestidos com quatro camadas de Nafion® (5%). Por último, fez-se a aplicação de um CFM30 numa experiência in vivo para medir a libertação de dopamina endógena no estriado de rato. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os dois tipos de microelétrodos revestidos com quatro camadas de Nafion® exibiram propriedades analíticas adequadas no que diz respeito à sensibilidade, LOD, seletividade e tempo de resposta, para medir a dopamina em tempo real em ambientes químicos complexos como é o caso do espaço extracelular do cérebroDopamine is a well-studied neurotransmitter belonging to the catecholamine group that is involved in several physiological neuronal processes such as motor development, movement control, reward, memory and perception. This neurotransmitter plays a critical role on some pathologies, namely Parkinson’s and Huntington's diseases, schizophrenia and addiction. Therefore, in vivo and ex vivo dopamine measurements are very important to understand the dopaminergic circuitry. Microdialysis and electrochemical techniques have been used extensively to measure dopamine in the brain. The use of electrochemical techniques is particularly attractive because of its high temporal and spatial resolutions, high sensibility and selectivity. These techniques are based on the use of microelectrodes such as carbon fibre microelectrodes, taking advantage of their micrometre dimension, excellent electrochemical properties and biocompatibility. In the present work, carbon fibre microelectrodes (CFMs) were hand-made fabricated with fibres of 7 and 30μm diameter (CFM7 and CFM30, respectively). The electrochemical active surface of the microelectrodes was coated with two and four layers of Nafion® (5%) or with a composite film of single-walled carbon nanotubes suspended in Nafion® (5%). An evaluation of the analytical properties sensitivity, selectivity, detection limit (LOD) and response time of the microelectrodes was performed using electrochemical techniques (e.g. cyclic voltammetry, square-wave voltammetry and amperometry). Additionally, electrochemical behaviour of dopamine was studied, namely its oxidation and reduction potentials, effect of pH and scan rate, aiming at understanding the redox reaction mechanism. By using cyclic voltammetry, it was observed that dopamine behaves like an almost-reversible electrochemical system, in which oxidation reactions were controlled by adsorption and by diffusion at low (100mV/s), respectively. The oxidation potential decreased with pH -56mV/pH and -69mV/pH for the CFM30 and CFM7, respectively. These results indicate that the reaction mechanism involves an electrochemical reaction of dopamine followed by a chemical reaction of its oxidation product (EC mechanism). By using square wave voltammetry the oxidation peak potential was determined to be +0,2V vs. Ag/AgCl. Furthermore, the relationship between the current peak and dopamine concentration departs from linearity for concentrations ≥2μM, which can be related with the adsorption of oxidation products onto the microelectrode surface. Abstract vi Both CFM30 and CFM7 microelectrodes were assessed in terms of sensitivity, limit of detection (LOD), selectivity and response time by amperometry in a flow injection analysis system (FIA). When compared with bare microelectrodes, coating with two or four layers of Nafion® (5%) slightly decreased the sensitivity and increased LOD (p>0.05). As expected, Nafion® significantly increased the microelectrode selectivity and delayed the response time in agreement with previous reports. Furthermore, the sensitivity and LOD were not improved by coating either type of microelectrodes with a composite film of single wall carbon nanotubes in Nafion® (5%). However, the selectivity increased significantly (p