Desenvolvimento e validação de novas metodologias anlíticas baseadas na MEPS/UHPLC-PDA para a determinação de antidepressivos em amostras de urina

Dissertação de mestrado em Medicina Legal e Ciências Forenses, apresentada á Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraA descoberta dos medicamentos antidepressivos no final dos anos 50, tornou a depressão um problema médico passível de tratamento. Assim sendo, nas últimas décadas, a psicofarmacologia da depressão evoluiu muito rapidamente, surgindo novos fármacos antidepressivos, retratando-se num aumento de 240% no consumo destes. Contudo, apesar da eficácia antidepressiva e da semelhante gama de indicações, cada antidepressivo possui propriedades individuais, não só farmacodinâmicas como também farmacocinéticas, resultando num perfil de indicações clínicas diferente, assim como efeitos adversos e inclusivamente interações medicamentosas. Além disso, a sua possível aquisição de forma ilegal, contribui para os problemas de automedicação e aumento do risco de suicídio por parte dos indivíduos. Assim sendo, e face aos efeitos colaterais causados por estes medicamentos, torna-se crucial o desenvolvimento de metodologias analíticas que possibilitem a identificação e quantificação destes fármacos em matrizes biológicas de uma forma rápida, simples e económica. Neste sentido, surge o presente estudo cujo objetivo prende-se com a determinação de dois antidepressivos de classes diferentes, nomeadamente a fluoxetina, a clomipramina e os respetivos metabolitos ativos norfluoxetina e desmetilclomipramina, em amostras de urina. Foram utilizadas duas técnicas de preparação de amostra distintas, a microextração por sorvente empacotado (MEPS) e o QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe), seguidas de análise por cromatografia líquida de ultra eficiência com detetor de fotodiodos (UHPLC-PDA). Foram avaliados neste trabalho os fatores que influenciam o desempenho da MEPS (tipo de sorvente, número de ciclos de extração, volume de amostra, pH da amostra, sistema de solventes e volume de eluição) e do QuEChERS (volume de amostra, solvente de extração, efeito salting out, etapa do clean up). As melhores condições de extração por MEPS foram obtidas usando um sorvente C18 como fase estacionária e 500 μL como volume de amostra de urina com 5 ciclos de extração. As análises dos extratos obtidos foram efetuadas com recurso a um sistema UHPLC-PDA, utilizando uma coluna analítica de fase reversa Acquity UPLC® HSS T3. A fase móvel utilizada consistiu numa mistura de acetonitrilo e uma solução aquosa de ácido fórmico a 0,1%, num gradiente de concentração ao longo da separação cromatográfica e com um fluxo constante de 250 μL/min. Relativamente à extração por QuEChERS as melhores condições foram adquiridas com 2 mL de amostra de urina e usando acetato de etilo como solvente de extração. Os extratos foram igualmente analisados utilizando o mesmo método cromatográfico descrito anteriormente. A validação dos métodos analíticos incluiu o estudo de vários parâmetros como a seletividade, linearidade, limiares analíticos, eficiência de extração, precisão e exatidão. Os métodos demonstraram ser seletivos para os compostos em estudo, uma vez que não foram detetados interferentes após a análise de amostras brancas de urina, com um desempenho aceitável em termos de linearidade, registando-se coeficientes de correlação (R2) acima de 0,996. Relativamente aos limites de deteção, estes mostraram-se igualmente satisfatórios com valores entre os 0,068 e 0,087 μg/mL para a MEPS, e entre 0,060 e 0,092 μg/mL para o QuEChERS. Quanto aos limites inferiores de quantificação, estes corresponderam à concentração mais baixa da curva de calibração (0,1 μg/mL). A extração evidenciou ser eficiente, tendo sido obtidas recuperações entre 99,4% e 107,1% para a MEPS e entre 93,7% e 102,2% para o QuEChERS. Por último, para avaliar a aplicabilidade dos métodos propostos, foram analisadas 12 amostras provenientes de pacientes em tratamento com os antidepressivos em estudo. As concentrações determinadas variaram entre 0,14 e 1,73 μg/mL para a MEPS e entre 0,13 e 1,58 μg/mL para o QuEChERS, permitindo assim evidenciar a capacidade dos dois métodos para identificar e quantificar este tipo de substâncias. Os métodos analíticos apresentados demonstraram ser eficientes, particularmente ao nível do tempo de análise, e suficientemente sensíveis para a deteção, identificação e quantificação da fluoxetina, clomipramina e respetivos metabolitos ativos em amostras de urina. De realçar, também, que a simplicidade das metodologias propostas torna-as compatíveis com a rotina analítica de um laboratório de toxicologiaThe discovery of antidepressant drugs in the late 50s has rendered depression as a treatable medical problem. Therefore, in recent decades, psychopharmacology of depression has evolved very quickly, emerging new antidepressant drugs, reflected in a 240% increase in their consumption. However, despite of antidepressant effectiveness and similar range of indications, each antidepressant has particular properties, not only pharmacodynamics but also pharmacokinetic, resulting in a different clinical indications profile as well as adverse effects and drug interactions. Furthermore, the illegal acquisition contributes to self-medication problems and increased risk of suicide among individuals. Therefore, and considering the side effects caused by these pharmaceutical drugs, it is essential to develop analytical methodologies that enable the identification and quantification of these drugs in biological matrices in a quick, simple and economical way. In this sense, this study aims the determination of two antidepressants from different classes, namely fluoxetine, clomipramine and their active metabolites, norfluoxetine and desmethylclomipramine, in urine samples. Two sample preparation techniques were used, the microextraction by packed sorbents (MEPS) and QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) followed by ultra high performance liquid chromatography with photodiode array detector (UHPLC-PDA) analysis. Factors that influence the performance of MEPS (type of sorbent material, number of extraction cycles, sample volume, sample pH, the solvent system and elution volume) and QuEChERS (sample volume, extraction solvent, salting out effect and clean up step) were evaluated in this work. The best extraction conditions for MEPS were obtained by using a C18 sorbent as stationary phase and 500 μL as urine sample volume with five extraction cycles. The analyses of the obtained extracts were performed by UHPLC-PDA system, using an Acquity UPLC® HSS T3 reverse-phase analytical column. The mobile phase contained acetonitrile and formic acid 0.1% in a gradient of concentration along the chromatographic separation, with a constant flow of 250 μL/min. Regarding to the QuEChERS extraction, the best conditions were acquired with 2 mL of urine sample and using ethyl acetate as extraction solvent. The extracts were also analyzed with the same chromatographic method previously described. Validation of the analytical methods included the study of selectivity, linearity, analytical thresholds, precision, accuracy and extraction efficiency. The methods proved to be selective for the studied compounds, since no interferences were detected after analysis of blank urine samples, with an acceptable performance in terms of linearity, with determination coefficients (R2) higher than 0.996. Concerning to the detection limits, these were equally satisfactory with values ranging between 0.068 and 0.087 μg/mL for MEPS and between 0.060 and 0.092 μg/mL for QuEChERS. As to the lower quantification limit this corresponded to the lowest concentration of the standard curve (0.1 μg/mL). Recoveries obtained were between 99.4% and 107.1% for MEPS and between 93.7% and 102.2% for QuEChERS. Finally, to evaluate the applicability of the proposed methods, 12 samples from patients under treatment with these antidepressants were analyzed. The determined concentrations varied between 0.14 and 1.73 μg/mL for MEPS and between 0.13 and 1.58 μg/mL for QuEChERS, which allowed demonstrate the ability of the method to identify and quantify this type of substances. The validated methods described in this work proved to be efficient, rapid and sensitive in the detection, identification and quantification of fluoxetine, clomipramine and their active metabolites in urine samples. The simplicity of this assay makes it suitable for the analytical routine in a toxicology laboratory