Células estaminais do cancro do endométrio. Caracterização, resposta à terapêutica e padrão de metastização in vivo

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraO cancro do endométrio é a neoplasia ginecológica mais frequente nos países ocidentais, habitualmente diagnosticado em estádios iniciais e na sexta década de vida. No entanto existe um grupo de doentes com doença recorrente e metastática cujo prognóstico é desfavorável e para as quais estão disponíveis opções terapêuticas com respostas modestas. As células estaminais do cancro (CSC, do inglês cancer stem cells) constituem uma população com propriedades de iniciação tumoral, de resistência à terapêutica e potencial de metastização. O principal objetivo deste estudo foi caracterizar a população de células do cancro do endométrio com propriedades de CSC in vitro, relativamente às suas características fenotípicas. Também se pretendeu avaliar a resposta das populações celulares ao tratamento com os citostáticos e com a irradiação. Finalmente foi também objetivo desenvolver um modelo animal ortotópico que permitisse prever o comportamento de cada população celular in vivo. Neste estudo experimental foram utilizadas diversas metodologias que se iniciaram pelo protocolo de formação de esferas in vitro e obtenção de populações derivadas aderentes. As populações celulares foram caracterizadas no que respeita à avaliação da expressão de marcadores moleculares por citometria de fluxo, à expressão de proteínas por western blot, à captação da fluordesoxiglicose marcada com flúor-18 (18F-FDG, do inglês fluorine-18-fluordeoxyglucose), ao metabolismo por ressonância magnética e ao proteoma por eletroforese bidimensional. O estudo da resposta à terapêutica foi realizada pela avaliação da atividade metabólica, das vias de morte celular por microscopia de fluorescência e da genotoxicidade através do ensaio cometa. O modelo animal ortotópico de cancro do endométrio foi desenvolvido em ratos imunodeprimidos e foi avaliado por imagem molecular e estudos ex vivo. As três populações de esferas e as três populações de células derivadas aderentes foram obtidas a partir da linha celular de cancro do endométrio ECC-1. A capacidade de formação de esferas variou de 2,22% a 2,54% e a capacidade de autorrenovação foi superior na última geração de esferas, a qual também apresentou menor área de projeção. A marcação de CD133, de CD44 e a expressão da aldeído desidrogenase (ALDH, do inglês aldehyde dehydrogenase) foi superior nas populações de esferas e a expressão da β-catenina foi também tendencialmente superior nestas células. Enquanto a expressão de recetores de estrogénios α foi menor nas esferas, a expressão de recetores de estrogénios β e de recetores de progesterona manteve-se inalterada. A expressão de P53 também foi inferior nas populações de esferas comparando com as restantes populações. O estudo do metabolismo da glicose revelou uma maior captação de 18F-FDG pela população de esferas que também apresentaram uma produção inferior de lactato e um maior acoplamento da glicólise ao ciclo de Krebs em relação à linha celular parental e à população de derivadas aderentes, o que sugere uma preferência pelo metabolismo oxidativo. A eletroforese bidimensional revelou a sobre-expressão de vários spots nas populações de esferas e de derivadas aderentes em relação à linha parental, que poderão ser alvo de identificação de modo a contribuir para o desenvolvimento de biomarcadores e para a identificação de moléculas para terapêuticas dirigidas. A tumorigénese das populações celulares estudadas foi patenteada pelo modelo heterotópico, que revelou um crescimento mais precoce nos tumores com origem nas populações de esferas. A resposta aos citostáticos revelou uma maior atividade metabólica na população de esferas, particularmente quando submetidas ao tratamento com doxorrubicina ou com paclitaxel. Para este citostático verificou-se um maior fator de sobrevivência na população de esferas. Esta população apresentou a morte por apoptose diminuída no caso do tratamento com carboplatina ou com paclitaxel. A migração do DNA foi menor na população de esferas submetidas ao paclitaxel e não se observou fragmentação do DNA com o tratamento com carboplatina. A resposta à irradiação originou diferenças biológicas reduzidas, em que se salientou a atividade metabólica superior em algumas populações de esferas e de derivadas aderentes. O fator de sobrevivência foi superior nas populações de esferas e de derivadas aderentes irradiadas com 0,5 Gy, mas com as doses de 15 Gy e de 30 Gy as derivadas aderentes apresentaram maior sobrevivência. A morte por apoptose foi menor na população de esferas, no entanto este tipo de morte destacou-se na população de derivadas aderentes. Os danos no DNA foram menores nas populações de esferas e de derivadas aderentes em relação à população parental. O modelo ortotópico revelou uma metastização mais frequente nos animais injetados com as esferas. O perfil imunohistoquímica para o Ki67, a P53 e a E-caderina foi semelhante entre os tumores primários e as metástases. A expressão de ALDH foi também semelhante nos tumores derivados das diferentes populações celulares e não se observou uma variação em relação às metástases. A β-catenina verificou-se aumentada nas metástases em relação aos tumores. A população com propriedades de CSC do cancro do endométrio apresentou capacidade de autorrenovação e de diferenciação, expressou marcadores de CSC e demonstrou um fenótipo mais indiferenciado. Esta população apresentou preferência pelo metabolismo oxidativo em detrimento da fermentação láctea, comparando com as populações aderentes, o que poderá representar uma população com menor proliferação. De um modo geral as esferas foram mais resistentes ao tratamento e apresentaram maior potencial metastático. A continuação da caracterização destas populações de células tumorais pode constituir um contributo para o diagnóstico precoce, adequação da terapêutica e desenvolvimento de terapêuticas dirigidas a alvos moleculares.Endometrial cancer is the most common gynaecological malignancy in western countries and is usually diagnosed in early stages and in the sixth decade of life. However there is a group of patients with recurrent and metastatic disease whose prognosis is poor, for whom treatment options available show modest responses. The cancer stem cell (CSC) constitute a population with properties of tumour initiation, resistance to therapy and metastatic potential. The aim of this study was to characterize the population of endometrial cancer cells with CSC properties in vitro, relative to its phenotypic characteristics. It was also intended to evaluate the response of the cell populations to treatment with chemotherapeutic agents and irradiation. Finally it was also aimed to develop an orthotopic animal model that allowed predicting the behaviour of each cell population in vivo. In this experimental study several methodologies were used, starting with the spheres formation protocol in vitro and the obtention of derived adherent populations. The cell populations were characterized regarding the evaluation of the expression of molecular markers by flow cytometry, the expression of proteins by western blot, the uptake of fluordesoxiglicose labelled with fluorine-18 (18F-FDG), the metabolism by magnetic resonance and the proteome by two-dimensional electrophoresis. The evaluation of response to therapy was performed using the evaluation of metabolic activity, of cell death pathways by fluorescence microscopy and of genotoxicity through the comet assay. The orthotopic animal model of endometrial cancer was developed in immunosuppressed rats and evaluated with molecular imaging and ex vivo studies. The three sphere populations and the three derived adherent populations were obtained from the endometrial cancer cell line ECC-1. The spheres formation capability was 2.22% to 2.54%, and self-renewal capacity was higher in the last generation of spheres, which also showed lower projection area. The CD133 and CD44 labelling and the expression of aldehyde dehydrogenase (ALDH) were higher in spheres populations and β-catenin showed tendency to be increased in spheres. While the expression of oestrogen receptors αwas smaller in spheres, the oestrogen receptor βand progesterone receptor expression remained unchanged. P53 expression was also lower in sphere populations compared with the other populations. The glucose metabolism studies showed a higher uptake of 18F-FDG for the sphere populations, which also showed a lower lactate production and an increased coupling of glycolysis to the Krebs cycle in relation to the parental cell line and the population of adherent derived cells, which suggests a preference for oxidative metabolism. Two dimensional electrophoresis revealed and over-expression of various spots in the population of spheres and derived adherent cells comparing with parental line, which can lead to the identification of targets to contribute to the development of biomarkers and identification of molecules for targeting therapies. The tumorigenesis of cell populations studied was observed in a heterotopic model, which showed an earlier growth of tumours for the sphere populations. The response to cytostatics showed an increased metabolic activity in the sphere populations, especially when submitted to treatment with doxorubicin and paclitaxel. For this cytostatic there was a higher survival factor in spheres populations. This population showed decreased apoptosis cell death in the case of treatment with carboplatin and paclitaxel. The DNA migration was lower in the sphere population submitted to paclitaxel and no DNA fragmentation was observed with treatment with carboplatin treatment. The response to irradiation led to small biological differences, emphasizing higher metabolic activity in some sphere and derived adherent populations. The survival factor was higher in spheres and derived adherent populations with 0.5 Gy, but with the dose of 15 Gy and 30 Gy the derived adherent populations had superior survival. Apoptotic cell death was lower in sphere populations, however this type of death was observed in the derived adherent population. DNA damage was smaller in sphere and derived adherent populations than parental cell line. The orthotopic model revealed a more frequent metastasis in the animals injected with spheres. The immunohistochemical profiles for Ki67, p53 and E-cadherin were similar in primary tumours and metastasis. The ALDH expression was similar in tumours derived from different cell populations and there was no variation in relation to metastasis. The β-catenin was increased in metastasis compared with the tumours. The population of endometrial cancer with CSC properties presented self-renewal capacity and differentiation, expressed CSC markers and demonstrated a more undifferentiated phenotype. This population showed preference for oxidative metabolism instead of lactic fermentation, compared with the adherent populations, what can represent a population with decreased proliferation. Generally, the spheres were more resistant to therapy and presented an increased metastatic potential. Continuing the characterization of tumour cell populations may constitute a contribution to the earlier diagnosis, adequacy of treatment and development of targeted therapies.FCT - SFRH/SINTD/60068/200