Modulation of intestinal inflammation by dietary polyphenols in comparison with 5-aminosalicylic acid: an in vitro approach

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, no ramo de Bioquímica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraInflammatory Bowel Disease (IBD) is a chronic and relapsing disorder of the gastrointestinal tract, whose etiology remains not fully understood. Given that, until now, IBD does not have cure and the results achieved with the conventional pharmacological treatment are clearly unsatisfactory, there is a great interest in exploring alternative strategies effective in limiting IBD progression. On the other hand, dietary polyphenols, allying their putative anti-inflammatory activity to their antioxidant effect, have been considered promising molecules for the prevention and treatment of several chronic inflammatory disorders and, for this reason, they have been receiving particular attention in the case of IBD. In this context, the work developed in the present Thesis aimed, primarily, to contribute for an extensive clarification of the molecular mechanisms underlying the anti-inflammatory effects of two structurally different polyphenolic compounds, the anthocyanin cyanidin-3-glucoside (C3G), and the stilbene resveratrol (Resv), both present in the Mediterranean diet, and secondly to compare these effects with those of a well-known anti-inflammatory drug, 5-aminosalicylic acid (5-ASA), in the same experimental conditions. With this purpose, a human intestinal cell line (HT-29) was employed and upon cell treatment with each polyphenol per se or in combination with 5-aminosalicylic acid (5-ASA), at the concentrations predictably reached at the intestinal level (25 μM for the polyphenols and 500 μM for 5-ASA), the cells were exposed to a combination of cytokines (IL-1α, TNF-α and IFN-γ) for a certain period of time. In the first phase of this study, it was demonstrated the ability of C3G and Resv to counteract the production of cytokine-induced pro-inflammatory mediators, such as nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2), and the expression of cytokine-induced pro-inflammatory enzymes, namely iNOS and COX-2, without affecting the activation of nuclear factor kB (NF-kB), but decreasing the amount of activated STAT1 in the nucleus of HT-29 cells. It was also shown that, unlike 5-ASA, Resv inhibited the activation of JNK but neither Resv nor 5-ASA were able to inhibit the activation of p38 MAPK in cytokine-stimulated HT-29 cells. In a second stage of this work, the involvement of Nrf2 and PPAR-γ pathways in the anti-inflammatory action of C3G and Resv were investigated in comparison with 5-ASA. It was demonstrated that both C3G and Resv were able to induce Nrf2 activation, to increase the ARE-regulated mRNA expression of two important enzymes, hemoxygenase-1 (HO-1) and glutamate cysteine ligase (GCL), to enhance the ratio of reduced glutathione (GSH) to oxidized glutathione (GSSG) and to inhibit the production of reactive species, in cytokine-challenged cells. Furthermore, unlike C3G, Resv and 5-ASA increased the amount of PPAR-γ in the nucleus of these stimulated cells. Considering the difference in the concentrations used in this study, the obtained results suggest that both C3G and Resv could have a higher anti-inflammatory and antioxidant capacity than the conventional drug 5-ASA. Although the undertaken in vitro studies did not provide evidence to support an additive or synergistic effect resulting from the association of C3G or Resv with 5-ASA, such effect cannot be excluded in animal models of the disease or in human patients. In conclusion, the results of this study contribute not only to clarify the action mechanisms behind the anti-inflammatory effects of C3G and Resv, by revealing their involvement in key inflammation-related cellular signalling pathways, but also to reinforce the envisagement of these compounds as promising nutraceuticals in combination to conventional drugs and to open windows for the selection of other natural compounds to defeat inflammatory bowel disease.A Doença Inflamatória Intestinal (DII) é uma patologia de carácter crónico e recidivante que afeta o trato gastrointestinal e cuja etiologia ainda não se encontra completamente esclarecida. Dado que, até ao momento, ainda não foi encontrada a cura para a DII e o recurso ao tratamento farmacológico convencional conduz a resultados que são claramente insatisfatórios, o desenvolvimento de estratégias alternativas que sejam eficazes para prevenir a progressão desta doença continua a constituir objeto de intensa investigação. Por outro lado, os polifenóis da dieta, aliando a sua potencial atividade anti-inflamatória ao seu efeito antioxidante, têm sido considerados promissores na prevenção e tratamento de várias doenças inflamatórias crónicas e, por esta razão, têm recebido particular atenção no caso da DII. Neste contexto, o trabalho desenvolvido na presente Dissertação teve como objetivo, em primeiro lugar, contribuir para o esclarecimento dos mecanismos moleculares subjacentes à atividade anti-inflamatória de dois polifenóis estruturalmente diferentes, a antocianina cianidina-3-glucósido (C3G) e o estilbeno resveratrol (Resv), normalmente presentes na dieta Mediterrânica, e, em segundo lugar, comparar esses efeitos com os de um fármaco convencional, o ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), nas mesmas condições experimentais. Para esse efeito, as células HT-29 foram inicialmente tratadas com os polifenóis, individualmente ou em combinação com o 5-ASA, em concentrações previsivelmente atingíveis no intestino (25 μM no caso dos polifenóis e 500 μM no caso do 5-ASA) e, posteriormente, expostas a uma mistura de citocinas (IL-1α, TNF-α e IFN-γ) durante um determinado período de tempo. Numa primeira fase deste trabalho, foi demonstrada a capacidade da C3G e do Resv diminuírem quer a produção de mediadores pro-inflamatórios, como o óxido nítrico e a prostaglandina E2, quer a expressão de enzimas pro-inflamatórias, como a iNOS e a COX-2, sem afetarem, no entanto, a ativação do fator nuclear kB, em células estimuladas pelas citocinas. Contudo, nestas células, a quantidade de STAT1 ativada diminuiu significativamente no núcleo. Foi também demonstrado que o Resv, ao contrário do 5-ASA, inibiu a ativação da JNK, mas nem o Resv nem o 5-ASA foram capazes de inibir a ativação da p38 MAPK nas mesmas células estimuladas. Numa segunda parte do trabalho, foi investigado o envolvimento das vias do Nrf2 e do PPAR-γ no efeito protetor referido da C3G e do Resv nas células HT-29 sob ação das citocinas, em comparação com o fármaco 5-ASA. Ambos os compostos demonstraram serem capazes de induzir a via do Nrf2, de aumentar a expressão de RNA mensageiro de duas enzimas importantes, a hemoxigenase-1 e a glutamato cisteína ligase, de aumentar a relação entre o glutatião reduzido (GSH) e o glutatião oxidado (GSSG) e de inibir a produção de espécies reativas nessas células estimuladas pelas citocinas. Adicionalmente, o Resv e o 5-ASA, mas não a C3G, aumentaram a quantidade de PPAR-γ no núcleo das mesmas células estimuladas. Atendendo à diferença de concentrações usadas neste estudo, os dados obtidos sugerem que tanto a C3G como o Resv possuem uma capacidade anti-inflamatória e antioxidante superior à do fármaco convencional 5-ASA. Embora os resultados deste estudo in vitro não tenham indicado um efeito aditivo ou sinergético entre a associação da C3G ou do Resv com o 5-ASA, a ocorrência desse efeito em modelos animais da doença ou em humanos não pode ser excluída. Em conclusão, os resultados deste estudo contribuem para o esclarecimento dos mecanismos de ação anti-inflamatória da C3G e do Resv, ao revelarem o seu envolvimento em vias de sinalização celular críticas no processo inflamatório, reforçam o carácter promissor destes compostos como nutracêuticos adjuvantes da terapêutica convencional e abrem caminho à seleção de outros compostos naturais para o combate da doença inflamatória intestinal.FCT - SFRH/BD/7541/201