Meeting the needs of breast cancer: a nucleolin's perspective

Tese de doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, no ramo de Oncobiologia, apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de CoimbraTreatment and management of breast cancer impose a heavy burden on the public health care, while the incidence rates continue to increase. Breast cancer is the most common female malignancy and primary cause of death among women worldwide. The major contributor for the disease-associated deaths is the development of breast cancer metastases, which renders this malignancy a manageable but incurable status. Although only 5 – 10% of newly diagnosed breast cancer patients present with metastasis to distant organs, the risk of recurrence in patients following successful primary tumor resection and adjuvant therapy prevail high. The therapeutic approaches in the setting of metastatic breast cancer are determined based on the characteristics of the primary tumor. However, given the heterogeneity between primary tumors and metastases observed at the molecular level is expectable that these strategies might be reveal ineffective against the secondary lesions. Hence, understanding the molecular basis of cancer cell dissemination and uncovering its vulnerabilities are imperative for the development of new therapeutic agents capable of tackling the metastases. Moreover, the molecular complexity of breast cancer changed our view about the biologic diversity of this disease and, particularly, altered the way clinical treatment decisions are made. Both molecular and immunohistochemical panels of biomarkers are currently being applied to predict the benefit of specific therapies such as endocrine and HER2-targeted therapy. However, a subset of women diagnosed with breast cancer bear the triple-negative (ER–/ PR–/ HER2–) phenotype, which is associated to a worse prognosis due to its pattern of time and sites of recurrence. Alongside with the metastatic progression, the triple-negative neoplasias constitute one of the most challenging hurdles of breast cancer. Since this subtype derives no benefit from the above-mentioned molecularly targeted treatments, and currently no tailored therapies exist for these patients, it urges the need of new therapeutic targets. It is recognized the crucial role of mouse models as tools for the advancement in the knowledge of cancer pathogenesis. However, the unavailability of such models that accurately replicate the human tumor progression has been a handicap. In the present work, it is described the optimization of the commonly used 4T1 metastatic breast carcinoma mouse model. We demonstrated that 4T1 tumors grew in the mammary fat pad of mice when as few as 500 cancer cells were implanted, with 87% tumor incidence. By reducing the inoculated cell density it was possible to achieve a superior metastatic efficiency; lungs was the primary organ affected by secondary lesions, though these were also common in other tissues such as the mesentery and pancreas. In addition, extended times for metastatic progression were attained without the need for primary tumor resection. This will enable a better assessment of the various steps in metastasization, and could be of importance for longitudinal studies and evaluation of antimetastatic therapies. Using the optimized 4T1 metastatic breast cancer mouse model, we investigated the therapeutic potential of an F3-peptide-targeted lipid-based nanoparticle in the setting of metastatic breast carcinoma. These nanoparticles act as nanocarriers for the targeted and specific delivery of drugs to both cancer cells and endothelial cells in the tumors overexpressing nucleolin. This protein has long been implicated in various processes supporting tumorigenesis and angiogenesis, and its involvement in mechanisms of metastasis has also been uncovered. Here we have demonstrated the specific binding of F3-targeted liposomes with three metastatic breast cancer cell lines enabling F3-pSL formulations to be more effective in promoting murine cancer cell death. We also validated the strategy’s rationale in targeting nucleolin both at the primary tumors and metastases, since the protein was overexpressed in these tissues. However, the in vivo therapeutic activity of Pegasemp (a large-scale version of F3-pSL produced according to the Good Manufacturing Practices) did not surmount the overall efficacy of pegylated liposomal doxorubicin (Caelyx®). The F3-targeted nanoparticles were not able to prevent the development of already established metastases, but had an effect in avoiding further dissemination of 4T1 cancer cells, shed from the tumor following treatment. In order to emphasize the therapeutic potential of nucleolin-targeted strategies, and the prognostic value of nucleolin, we analyzed the protein’s expression in both primary tumors and respective lymph node metastasis of patient-derived tissues, regardless of hormone-receptor status. Overexpression of the protein was confirmed in all primary carcinomas (10/10) but not in all lymph node metastases (6/10). Additionally, the expression of nucleolin was assessed in a larger cohort of triple-negative breast tumor biopsies. In this group of patients, 78% were nucleolin-positive. Moreover, the expression of this protein was positively correlated with the presence of basal cytokeratins 5/6, which are indicators of worse prognosis within the triple-negative phenotype. Distinct expression patterns of nucleolin were also found between luminal A and triple-negative breast cancers. Therefore, there is a possible role for nucleolin as a prognostic variable in the triple-negative breast cancer setting that might be related to the pattern rather then absolute expression. Also, therapeutic strategies that target this protein could be promising for both metastatic (irrespective of hormone receptor status) and triple-negative breast cancers.O tratamento do cancro da mama e a sua gestão constituem um enorme problema para a saúde pública, e para o qual tem contribuído o crescimento taxa de incidência desta doença. Sendo este o tipo de tumor que mais afecta as mulheres, o principal responsável pelas mortes associadas ao cancro da mama é desenvolvimento de metástases, conferindo à doença um status tratável mas incurável. Apesar de apenas 5 – 10% das mulheres diagnosticadas de novo apresentarem lesões em órgãos distantes, o risco de recorrência nas doentes após mastectomia e terapia adjuvante continua a ser elevado. Neste contexto de cancro da mama metastático, as abordagens terapêuticas continuam a ser determinadas com base nas características do tumor primário. No entanto, dada a heterogeneidade observada a nível molecular entre o tumor primário e as suas metástases, é expectável que estas estratégias possam ser pouco eficientes contra os tumores secundários que se desenvolvem. Desta forma, compreender as bases moleculares da disseminação das células cancerígenas e revelar as suas vulnerabilidades é fundamental para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos capazes de alcançar as metástases. O reconhecimento da complexidade molecular do cancro da mama mudou a forma como encaramos a diversidade biológica desta doença e, em particular alterou a forma como as decisões terapêuticas são efectuadas. Actualmente, o prognóstico terapêutico para as terapias endócrinas e trastuzumab é calculado a partir de um painel de biomarcadores moleculares e imunohistoquímicos. Contudo, há um conjunto de mulheres que são diagnosticadas com cancro da mama triplo-negativo (ER–/ PR–/ HER2–), o qual está associado a um pior prognóstico devido ao timing e locais para onde metastizam estes tumores. A par da progressão metastática, as neoplasias da mama triplo-negativas constituem um dos desafios mais difíceis desta doença. Uma vez que este subtipo de cancro da mama não beneficia das terapias específicas mencionadas anteriormente, e não existindo actualmente uma terapia dedicada para estas doentes, surge uma grande necessidade da descoberta de novos alvos terapêuticos. A utilização de modelos animais é uma ferramenta importante e com papel reconhecido para o avanço do conhecimento na génese do cancro. No entanto, a falta de modelos que mimetizem de forma fiel a progressão dos tumores humanos tem sido um obstáculo. Neste trabalho descreve-se a optimização de um modelo animal (4T1) comummente utilizado no estudo do cancro da mama metastático. Foi demonstrado que os tumores 4T1 crescem nas glândulas mamárias dos ratinhos quando são inoculadas apenas 500 células, e com uma taxa de incidência de 87%. A redução da densidade celular inoculada permitiu obter uma eficiência metastática superior, onde os pulmões foram o órgão mais afectado pelas lesões secundárias; o desenvolvimento de lesões tumorais no mesentério e pâncreas foram também comuns. O tempo para a progressão metastática neste modelo foi também maior, sem que para tal tivesse sido necessária a ressecção tumoral. Esta optimização permitirá estudar os vários passos da metastização, e poderá ser relevante em estudos longitudinais e terapêuticos. Utilizando o modelo animal optimizado, procedeu-se à determinação do potencial terapêutico de uma nanopartícula de base lipídica e vectorizada com o peptídeo F3 (F3-pSL) no contexto do cancro da mama metastático. Estas nanopartículas actuam como veículos para a entrega direccionada de fármacos nas células cancerígenas e células endoteliais dos vasos tumorais que sobreexpressam nucleolina. Desde há muito tempo que esta proteína tem sido implicada na tumorigénese e angiogénese e, mais recentemente, em mecanismos pró-metastáticos. Neste trabalho demonstrou-se a ligação específica da formulação F3-pSL com três linhas celulares de cancro da mama metastático, promovendo desta forma o efeito citotóxico da doxorubicina encapsulada. A validação da nucleolina como alvo da estratégia terapêutica foi efectuada através da confirmação da sua sobreexpressão nos tumores primários e correspondentes metástases. Contudo, a actividade terapêutica do Pegasemp (versão GMP do da formulação F3-pSL) não foi superior em eficácia ao equivalente de doxorubicina lipossoma existente no mercado (Caelyx®). Apesar do Pegasemp não ter sido eficaz a conter o desenvolvimento das lesões já estabelecidas aquando do início do tratamento, teve ainda assim um efeito parcial na disseminação das células cancerígenas 4T1. Para enfatizar o valor prognóstico da nucleolina, e potencial terapêutico das estratégias que têm como alvo esta proteína, foi realizada a análise da sua expressão em tecidos humanos de tumores primários da mama e correspondentes nódulos linfáticos metastizados, independentemente da expressão dos receptores hormonais. A sobreexpressão da nucleolina foi confirmada em todos os tumores primários (10/10) mas não em todas as lesões nodulares (6/10). Adicionalmente, a expressão desta proteína foi avaliada num grupo maior de biópsias de carcinoma da mama triplo-negativo. Nesta amostragem, 78% dos tecidos era positivo para a nucleolina, onde também se constatou uma correlação positiva com a presença das citoqueratinas 5/6, indicadoras de pior prognóstico no fenótipo triplo-negativo. Da mesma forma foi revelada a existência de padrões distintos de expressão da nucleolina entre os tipos de cancro luminal A e triplo-negativo. Assim, é possível que o padrão de expressão da nucleolina, além da sua expressão absoluta, possa ter um papel como factor de prognóstico no cancro da mama triplo-negativo. Adicionalmente, as estratégias terapêuticas que têm esta proteína como alvo poderão ser promissoras para o tratamento do cancros da mama metastático (independentemente dos receptores hormonais) e triplo-negativo