Mechanisms of aging: neuronal orchestration of stress resistance and protein homeostasis in the nematode Caenorhabditis elegans

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraO envelhecimento é um processo complexo que ocorre em todos os organismos, da levedura ao Homem. Apesar de um século de pesquisa e discussão científica, os factores subjacentes à progressão do envelhecimento permanecem por clarificar. Mas os ângulos sob os quais este processo é visto sofreram grandes mudanças com o tempo. As primeiras teorias sugeriam que o envelhecimento decorre da acumulação estocástica de danos nas macromoléculas, levando ao mal funcionamento dos organismos e, por fim, à morte dos mesmos. Esta área de investigação foi radicalmente transformada nas últimas décadas por uma série de estudos pioneiros em diferentes modelos animais que mostraram claramente que o envelhecimento pode ser alterado através da manipulação de várias vias metabólicas e genéticas. Estas descobertas sugeriram que o nível de protecção de um organismo contra danos estocásticos pode ser regulado e, consequentemente, também o período de vida durante o qual o mesmo permanece saudável. No entanto, à medida que o conhecimento acerca destes mecanismos foi maturando, tornou-se evidente que a duração de vida, a resistência a stress e a homeostase proteica, aspectos que são regulados pelas vias que regulam o envelhecimento, podem ser desacopladas sem se influenciarem mutuamente. Mais recentemente, o processo de envelhecimento revelou possuir um nível adicional de complexidade quando se mostrou que pode ser coordenado por diferentes tecidos ao nível do organismo. Neste trabalho, o nosso interesse focou-se nos princípios subjacentes à orquestração do envelhecimento ao nível do organismo, bem como na dissociação entre duração de vida, resistência a stress e homeostase proteica. De modo a abordar estes temas, usámos o nemátode Caenorhabditis elegans (C. elegans), modelo animal que oferece inúmeras vantagens no estudo do envelhecimento. Começámos por investigar os mecanismos de comunicação entre tecidos que regulam a heat shock response (HSR) a nível do organismo no modelo C. elegans, procurando, mais concretamente, esclarecer que receptores neuronais estão envolvidos neste mecanismo de sinalização e em que neurónios desempenham a sua função. Para responder a estas questões, empregámos nemátodes geneticamente modificados que apresentam hipersensibilidade a RNA de interferência (RNAi) no tecido nervoso e identificámos um presumível receptor acoplado a proteínas G (GPCR) como sendo um componente-chave deste mecanismo. Este gene, a que atribuímos o nome gtr-1, é expresso em neurónios quimiosensoriais e desempenha um papel fundamental na indução de genes que codificam proteínas de heat shock nos tecidos somáticos após exposição a temperaturas elevadas, apesar de não ser necessário à percepção de calor. Surpreendentemente, o knockdown do gtr-1 através de RNAi tem um efeito protector em nemátodes que expressam nos músculos Aβ3-42 (um péptido com tendência agregativa associado à doença de Alzheimer), mas não influencia a duração de vida, a resistência a outros stresses ou funções associadas ao desenvolvimento. Na segunda parte deste trabalho pretendemos fazer uma caracterização mais detalhada dos elementos downstream à via de sinalização da insulina/IGF-1 (IIS) que estão directamente envolvidos na regulação da toxicidade proteica em C. elegans. Com este objectivo, procurámos genes previamente citados na literatura como reguladores da homeostase proteica e identificámos o tor-2 como sendo regulado ao nível da transcrição pela via IIS. Nesta tese mostramos que a expressão do tor-2 é induzida após a supressão desta via pelos factores de transcrição DAF-16 e SKN-1. Este gene revelou-se importante na resistência a temperaturas elevadas mas não na regulação do tempo de vida do animal ou na resistência a outros tipos de stress tais como exposição a bactérias patogénicas ou a radiação UV. Curiosamente, o tor-2 parece ser importante no combate à toxicidade proteica em neurónios, onde se mostrou anteriormente que este gene é expresso, ao passo que o seu knockdown protege os nemátodes que expressam proteínas agregativas tóxicas nos músculos. Este estudo oferece novas ideias: (1) que os neurónios quimiosensoriais desempenham um papel importante nos mecanismos que regulam a HSR no nemátode; (2) que o tempo de vida e a resistência a heat shock são separáveis; (3) consolida o conceito emergente de que a habilidade para responder o calor existe em detrimento da manutenção da proteostase; e (4) sugere que a homeostase proteica pode ser diferencialmente regulada de tecido para tecido por um único gene.Aging is a complex process that occurs in organisms ranging from yeast to humans. The factors underlying the progression of aging still elude us, despite a century of scientific inquiry and discussion. Nevertheless, the angles from which aging was perceived have greatly changed over time. Early theories suggested that aging results from the accumulation of stochastic damage to macromolecules, leading to organismal malfunction and ultimately death. The field was however revolutionized over the last decades by a series of pioneering studies carried out in model organisms that showed that aging can actually be altered by the modification of several metabolic and genetic pathways. These findings suggested that the level of protection against stochastic damage can be regulated and, hence, the length of time an organism remains healthy. However, as the knowledge on these mechanisms matured, it became evident that lifespan, stress resistance, and protein homeostasis (proteostasis), aspects that are regulated by the aging-modulating pathways, can be uncoupled without influencing one another. The aging process revealed another level of complexity when it was shown to be coordinated by different tissues in an organismal-fashion. In this work, we were interested in the principles underlying the orchestration of aging at the organismal level, as well as in the uncoupling between lifespan, stress resistance, and proteostasis. To address these questions, we employed the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans), which offers key advantages in the study of aging. We started by focusing on the inter-tissue communication mechanisms that regulate the heat shock response (HSR) at the organismal level in C. elegans and attempted to clarify which neuronal receptors are required for this signaling mechanism and in which neurons they function. To answer these questions, we employed worms that were engineered to exhibit RNA interference (RNAi) hypersensitivity in neurons and identified a putative G protein-coupled receptor (GPCR) as a novel key component of this mechanism. This gene, which we termed GPCR thermal receptor 1 (gtr-1), is expressed in chemosensory neurons and has no role in heat sensing but is critically required for the induction of genes that encode heat shock proteins in non-neural tissues upon exposure to heat. Surprisingly, the knockdown of gtr-1 by RNAi protected worms expressing the Alzheimer's-disease-linked aggregative peptide Aβ3-42 in their body-wall muscles from protein toxicity (proteotoxicity) but had no effect on lifespan, resistance to other stresses, or developmental functions. In the second part, we aimed at better characterizing the insulin/IGF-1 signaling (IIS)-downstream components involved in the direct regulation of protein toxicity (proteotoxicity) in the C. elegans model. For this, we searched for genes that are known regulators of proteostasis and identified tor-2 as a transcriptional target of the IIS pathway. Here we show that tor-2 is upregulated upon suppression of the IIS by both DAF-16 and SKN-1transcription factors. This gene is important for the resistance to heat shock but has no role in the determination of lifespan or in the resistance to other acute stresses such as exposure to pathogenic bacteria or to UV radiation. Interestingly, tor-2 seems to be important to counteract proteotoxicity in neurons, previously shown to be its main site of expression, whereas its knockdown protects worms that express toxic, aggregative-proteins in their body-wall muscles. In this work we provide several novel insights: (1) we show that chemosensory neurons play important roles in the nematode's HSR-regulating mechanism; (2) that lifespan and heat stress resistance are separable; (3) we strengthen the emerging notion that the ability to respond to heat comes at the expense of proteostasis; and (4) suggest that proteostasis can be differentially regulated in a tissue-specific manner by a sole gene.FCT - SFRH/BD/70502/201