Modelos fosfolipídicos do sarcolema cardíaco : efeitos do cálcio e do pH

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada áo Departamento de Zoologia da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.The ultrastructure of cardiac muscle reveals that at many sites on the surface of cells the sarcolemma is invaginated to form a network of tubules with transverse and longitudinal orientation to which the sarcoplasmic reticulum is apposed to form dyads. Ca2+ channels and other exchangers engaged in the contractile cycle are mainly located closed to the dyadic cleft, and require fast flows and higher cytosolic concentrations of Ca2+ for the physiological activity. The subsarcolemmal dyadic region has been indicated as a compartment for restrict Ca2+ diffusion where most of cellular Ca2+ exchanges take place. The negatively charged phospholipids from the inner sarcolemmal leaflet represent the main locus for exchangeable Ca2+ binding sites. The pathological ischemic condition is associated with intracellular energy depletion and acidosis and is followed by sarcolemma destabilization, like loss of asymmetry, aggregation of intramembraneous constituents and disruption. Reperfusion after long ischemia may result in lipid extrusion from the sarcolemma. As phospholipids form the basic structural matrix of biological membranes, phospholipid models representative of the inner leaflet of the cardiac sarcolemma were prepared with the most abundant phospholipid molecule of the main phospholipid classes: 16:0/16:0-glycerophosphocholine (DPPC), 18:0/20:4-glycerophosphoetahnolamine (SAPE) and 18:0/20:4-glycerophosphoserine (SAPS). In the first section of this work, the SAPS was synthesized from commercially available 18:0/20:4-glycerophosphocholine (SAPC) by enzymatic synthesis with phospholipase D from Streptomyces sp.. Phospholipase D catalyses the hydrolysis of phosphatidylcholine with the production of phosphatidic acid. However, in the presence of serine, the enzyme also catalyzes the transfer of the phosphatidyl group to the nucleophilic acceptor (serine) with the simultaneous production of phosphatidylserine by transphosphatidylation. Because the synthesis reaction involves an hydrosoluble enzyme and lipophilic products and substrate, the synthesis was studied in a two phase system with an organic phase of diethyl ether and an aqueous solution saturated with L-serine at 30 ºC, under stirring. The maximal conversion of SAPC was reached after 2 hours of incubation with the transphosphatidylation as the main reaction. Although Ca2+ is not indispensable for the synthesis of SAPS, it was required for maximal transferase activity of thephospholipase D, about 74.32% of SAPS. In the presence of Ca2+ both activities were stimulated but the transphosphatidylation was favoured above hydrolysis. Increasing the reactor diameter or decreasing the stirring velocity resulted in less transferase activity in the two phase system. In the two phase system the substrate is presented in the monomeric form and the phospholipase D activity is stirring-dependent. In order to eliminate this dependence and to increase the interaction of the lipid substrate with the enzyme, the reaction was also carried out in inverted micelles. The maximal transphosphatidylation was 77.29% of SAPS. Under these conditions, Ca2+ stimulation is less effective and both activities were enhanced by the same factor, suggesting that the interactions substrate-substrate (lipid-lipid) are more important for the enzyme activity. The same results were obtained when the diameter of the reactor was increased and the stirring was less effective. The thermotropic profiles from differential scanning calorimetry (DSC) and from DPH fluorescence polarization of phospholipid models representative of the inner leaflet of the asymmetric sarcolemma were studied in order to monitor the perturbations induced by Ca2+ and H+ (under physiological and pathological conditions) in the interphospholipid interactions and phospholipid lateral arrangement. Models representing the total phospholipid composition of the sarcolemma were also studied in order to simulate the loss of asymmetry in the sarcolemma (symmetric composition). The studies were initiated with the binary mixtures DPPC/SAPE and DPPC/SAPS by keeping the compositions as described for the ternary mixtures and replacing the absent molecule by DPPC. The thermotropic profile of binary mixtures containing SAPS is defined by a unique transition which was not perturbed by the presence of Ca2+. However, an additional transition was induced by H+ for SAPS in the symmetric composition. These results suggest that the phosphatidylserine in the sarcolemma should grant miscibility and capability to interact with Ca2+ under physiological condition. However, under pathological condition, like ischemia, where loss of asymmetry and acidosis are involved, the phosphatidylserine may destabilize the membrane. For the binary mixtures containing SAPE in the asymmetric composition, only one transition was detected under physiologic pH. Besides, these mixtures showed sensitivity to different concentrations of Ca2+ and H+ with the detection of additional transitions. The mixtures containing SAPE in the symmetric composition are characterized by two stable transitions, which are not perturbed for the studied Ca2+ andH+ concentrations. These results suggest that the composition of the phosphatidylethanolamine should be precisely defined and maintained in the sarcolemma, in order to grant specific physical properties and dynamics to the membrane. In this way, the phosphatidylethanolamine may have an important role in the lipid asymmetry regulation. The ternary mixtures representative of the inner leaflet of the asymmetric sarcolemma have a thermotropic profile defined by a unique and highly symmetric transition ending next to the physiologic temperature, at 37 ºC. This transition occurs with an increase in the fluidity of the membrane core, typical of a transition between lamellar phases as detected by fluorescence polarization. The thermotropic profile and miscibility were not perturbed by Ca2+ concentrations under 7500 μM and pH 5.5. In the mixtures representative of the symmetric sarcolemma, two transitions were detected. An additional transition emerged in the presence of Ca2+ and increased with progressive concentrations of Ca2+. The thermotropic profile was not perturbed for pH above 5.5. These results suggest that under loss of sarcolemma asymmetry the phospholipids should adopt an irregular lateral arrangement into domains with distinct compositions, in order to maximize their interactions. The phospholipid classes composition of the inner leaflet of the asymmetric sarcolemma agrees closely with the predictions for a regular lateral arrangement of hexagonal geometry, and so the phospholipids should preferentially adopt a regular lateral arrangement which conduct to the detected miscibility. The loss of asymmetry will result in a significant decrease of phospholipid miscibility in the sarcolemma. Additional studies with saturated phospholipids indicate that the regular lateral arrangement may be determined mainly by the phospholipid classes composition. The acyl chains unsaturations also should be very important to grant the membrane fluidity and the stability to face the Ca2+ fluctuations in the dyadic cleft under the physiological temperature. Considering the results of these studies a sequence for the events involved in the ischemia condition is proposed.Aspectos ultra-estruturais do músculo cardíaco indicam que o sarcolema forma uma cadeia de invaginações (túbulos) transversais e longitudinais, favorecendo as zonas de justaposição com o retículo sarcoplasmático, designadas por fenda diádica. Por seu lado, canais e trocadores de Ca2+ envolvidos no ciclo contractivo estão preferencialmente localizados em zonas adjacentes à fenda diádica, e requerem na sua actividade fisiológica fluxos rápidos de Ca2+ e concentrações superiores às do citosol. A zona da fenda diádica é apontada como um compartimento de difusão restrita onde ocorre quase todo o fluxo celular de Ca2+, sendo os fosfolípidos aniónicos, existentes exclusivamente no folheto interno do sarcolema assimétrico, indicados como os principais locais de ligação do Ca2+ disponível para troca rápida. A situação patológica de isquemia (supressão da perfusão) associada intracelularmente com o esgotamento de energia e o decréscimo do pH (acidose), é também acompanhada por alterações estruturais do sarcolema como a perda de assimetria lipídica, o rearranjo lateral de constituintes membranares e perda de integridade. A reperfusão após períodos de isquemia prolongados pode resultar na extrusão de lípidos do sarcolema. Atendendo a que os fosfolípidos constituem a matriz estrutural das membranas biológicas, foram preparados modelos fosfolipídicos representativos do folheto interno do sarcolema cardíaco, constituídos pela espécie mais abundante de cada uma das classes fosfolipídicas mais representativas: 16:0/16:0-glicerofosfocolina (DPPC), 18:0/20:4-glicerofosfoetanolamina (SAPE) e 18:0/20:4-glicerofosfoserina (SAPS). A primeira parte do trabalho envolveu a síntese enzimática de 18:0/20:4- -glicerofosfoserina, catalisada pela fosfolipase D de Streptomyces sp., a partir 18:0/20:4-glicerofosfocolina (disponível comercialmente). A fosfolipase D catalisa a hidrólise da fosfatidilcolina com formação de ácido fosfatídico. No entanto, na presença de serina a enzima catalisa também a transferência do grupo fosfatidil para o aceitador nucleofílico (serina) com formação simultânea de fosfatidilserina, por transfosfatidilação. A reacção envolve uma enzima hidrossolúvel, um substrato e produtos lipossolúveis, pelo que a síntese foi estudada num sistema com duas fases, uma fase orgânica composta por éter dietílico e uma fase aquosa saturada com L-serina, a 30 ºC esob a agitação magnética. A conversão máxima foi atingida ao fim de 2 horas de reacção, sendo a transfosfatidilação marcadamente superior. A presença de Ca2+ não é essencial para a actividade da enzima mas é indispensável para se atingir a transfosfatidilação máxima, cerca de 74,32% de 18:0/20:4-glicerofosfoserina. Aliás, o Ca2+ estimula ambas as actividades, mas a transfosfatidilação é favorecida relativamente à hidrólise. O aumento do diâmetro do reactor ou a diminuição da velocidade de agitação do sistema traduzem-se numa redução da transfosfatidilação no sistema bifásico. No sistema bifásico, o substrato apresenta-se na forma monomérica e a actividade da enzima está dependente da eficiência da agitação. Para suprimir esta limitação e potenciar a interacção do substrato lipídico com a enzima, a reacção de síntese foi também estudada em micelas invertidas. A transfosfatidilação máxima foi cerca de 77,29% de 18:0/20:4-glicerofosfoserina. Nesta situação, a estimulação pelo Ca2+ foi menor, e ambas as actividades foram igualmente estimuladas, sugerindo uma maior importância das interacções substrato-substrato (lípido-lípido) na actividade da enzima. A actividade da enzima não foi alterado quando se reduziu a eficiência da agitação do sistema de micelas invertidas. Para detectar as alterações induzidas pelo Ca2+ e pelo H+ (em condições patológica e fisiologicamente relevantes) nas interacções inter-fosfolípidos e na distribuição lateral dos fosfolípidos do sarcolema, foram estudados os perfis termotrópicos por calorimetria diferencial de varrimento (DSC) e polarização de fluorescência do DPH, em modelos fosfolipídicos representativos do folheto interno do sarcolema cardíaco assimétrico. Foram também estudados modelos com as proporções representativas da fracção fosfolipídica total do sarcolema. Com o estudo da composição fosfolipídica total pretendeu-se simular as condições de perda de assimetria lipídica. No entanto, os estudos foram iniciados em misturas binárias com as espécies de fosfatidilcolina/fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina/fosfatidilserina, mantendo as proporções referidas para as misturas ternárias e substituindo a espécie ausente pela fosfatidilcolina. Nos estudos realizados com misturas binárias contendo SAPS constata-se que o seu comportamento termotrópico, caracterizado por uma transição única, não é alterado pela presença de concentrações crescentes de Ca2+, sendo apenas influenciado pelo aumento de H+, dado que se detecta de uma transição adicional quando a proporção deSAPS é reduzida, simulando a perda de assimetria. É assim possível sugerir que a fosfatidilserina deverá conferir ao sarcolema homogeneidade e capacidade de interacção com o Ca2+ em condições fisiológicas, devendo-se apresentar como factor de instabilidade em condições patológicas que envolvam a perda de assimetria seguida de acidose, como poderá ser o caso da isquemia. Por outro lado, nas misturas binárias contendo SAPE a pH fisiológico, apenas se detectou uma única transição para a proporção representativa do sarcolema assimétrico (33,7%). É também nesta proporção que as misturas com SAPE apresentaram susceptibilidade à presença e concentração de Ca2+ e à redução do pH com a detecção de transições adicionais. As misturas binárias com SAPE em proporção semelhante à do sarcolema simétrico apresentam sempre duas transições que não são susceptíveis aos catiões estudados. Estes resultados parecem indicar que a proporção de fosfatidiletanolamina no sarcolema tem de estar bem definida e mantida, a fim de conferir à membrana as propriedades físicas e a dinâmica características. Assim a fosfatidiletanolamina poderá constituir um elemento para a regulação da assimetria lipídica. As misturas ternárias, representativas do folheto citoplasmático do sarcolema assimétrico, apresentam um registo calorimétrico caracterizado por uma única transição com acentuada simetria, e que termina próximo da temperatura fisiológica, a 37 ºC. Esta coincide com um aumento da fluidez no interior da membrana característico de uma transição entre fases lamelares, como mostram os dados de polarização de fluorescência. O perfil termotrópico e a miscibilidade não são alterados na presença de concentrações de Ca2+ até 7500 μM e pH 5,5. Nas misturas representativas do sarcolema simétrico foram detectadas duas transições. A presença de Ca2+ induz o aparecimento de uma transição adicional, que se destaca com o aumento da concentração. O comportamento termotrópico não é alterado para valores de pH até 5,5. Estes resultados sugerem que em condições de perda de assimetria, os fosfolípidos se distribuem em domínios lipídicos distintos, com diferentes composições, de maneira a maximizar a interacção entre os seus constituintes. A composição do folheto interno do sarcolema assimétrico em termos de classes fosfolipídicas aproxima-se claramente dos valores previstos para um arranjo lateral regular de simetria hexagonal, pelo que os fosfolípidos deverão adoptar uma distribuição regular no plano da membrana, a qual é responsável pela miscibilidadedetectada. A perda de assimetria deverá traduzir-se num decréscimo significativo da miscibilidade dos fosfolípidos do sarcolema. Estudos adicionais com fosfolipídos saturados, indicam que a distribuição regular no plano da membrana deverá ser determinada pelas proporções das classes fosfolipídicas constituintes, sendo aparentemente independente das espécies. O grau de insaturação das cadeias acil deverá ser também muito importante, por garantir, à temperatura fisiológica, a fluidez da membrana e conferir resistência às variações do Ca2+ na fenda diádica. Considerando os resultados obtidos, foi proposta uma sequência para os eventos associados à situação patológica de isquemia