Marcadores moleculares nas células estaminais do cancro da mama triplo negativo versus hormonodependente

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Na prática clínica, o cancro da mama é estratificado em três grupos: cancros que expressam recetores hormonais (RH), cancros que sobrexpressam HER-2 e os cancros triplos negativos (TN) que não expressam nem RH, nem HER-2. Esta estratificação tem implicações diagnósticas e terapêuticas. A recente teoria das células estaminais do cancro (CSC) refere-se à existência de um pequeno grupo populacional de células que possuem características de células estaminais. Há evidências de que as CSC são responsáveis pela progressão do tumor, por recidivas e pela resistência à terapia. Este trabalho surge com vários objetivos, na perspetiva de comparar as células tumorais da mama que expressam RH e as TN, nomeadamente, isolar células estaminais derivadas destes tipos de tumores e células diferenciadas a partir destas, estudar o seu perfil fenotípico no que concerne à expressão de recetores com relevância clínica e de marcadores como a proteína P53 e ALDH e ainda comparar a resposta das linhas celulares à radioterapia. Para a realização destes objetivos utilizaram-se as linhas celulares HCC1806 e MCF7, representativas do cancro da mama TN e do cancro da mama que expressa RH, respetivamente. Estas células foram estudadas por imunocitoquímica (ICQ) de modo a conhecer as suas características morfológicas, avaliar e confirmar a expressão de RE-α, de RP, de P53 e de Ki-67. Ambas as linhas celulares foram submetidas ao protocolo de formação de mamosferas. A primeira geração de mamosferas (MS1) foi posteriormente cultivada em condições aderentes (G1). Este procedimento foi repetido mais duas vezes obtendo-se as respetivas gerações denominadas por MS2, MS3, G2 e G3. Com estas populações celulares obtiveram-se extratos de proteína total que foram utilizados para detetar e quantificar várias proteínas: ALDH, RE-α e RE-β, RP, HER-2 e P53. Alémdestes procedimentos, as linhas celulares HCC1806 e MCF7 ainda foram submetidas a radioterapia e a sua resposta foi avaliada pelo ensaio clonogénico. A ICQ revelou que estas células apresentam características de células tumorais, sendo a linha celular HCC1806 mais indiferenciada. A avaliação da expressão da ALDH, um marcador comum para células estaminais, confirmou a obtenção de CSC pelo protocolo de formação de esferas. Verificou-se também uma diferença de expressão entre a linha MCF7 e a linha HCC1806, em que a última tem uma expressão mais elevada o que aponta para uma maior estaminalidade (“stemness”) dos tumores triplos negativos. Os RE-α, RP e HER-2 não são expressos em HCC1806 e populações derivadas. O RE-β, expresso em ambas as linhas celulares, verificou-se diminuído nas CSC, nomeadamente, MS1, MS2 e MS3. Nas populações derivadas aderentes, G1, G2 e G2, verifica-se uma sobreposição com o fenótipo original. Este perfil de expressão também se verificou em relação às células da linha MCF7 e populações derivadas para os marcadores RE-α, RP e HER-2, bem como, para a P53. Os resultados obtidos apontam para o perfil de sub/desdiferenciação das CSC que se traduz por uma perda do fenótipo característico da célula e, certamente, tem implicações no comportamento clínico dos tumores. No que concerne à resposta à radioterapia verificou-se uma maior suscetibilidade e sensibilidade por parte das células triplas negativas. Esta resposta pode, em parte, ser justificada pelo superior índice proliferativo por parte das células triplas negativas. Os tumores da mama são um grupo heterogéneo. O isolamento de CSC e a sua caracterização é mais um patamar decisivo no esclarecimento da génese do cancro e da previsão da resposta à terapêutica.In clinical practice breast cancer is stratified into three groups: cancers that express hormonal receptors (HR), cancers that overexpress HER-2 and the triple negative (TN), that do not express RH or HER-2. This stratification has diagnostic and therapeutic implications. The recent theory of cancer stem cells (CSC) refers to the existence of a small population of cells having stem cell characteristics. There is evidence that CSC are responsible for tumor progression, recurrence and resistance to therapy. This work comes up with several objectives in the perspective of comparing breast tumor cells that express HR and TN ones, namely, isolating stem cells derived from these types of tumors and cells differentiated from the latter, to study their phenotypic profile regarding clinically relevant receptors and markers such as P53 and ALDH, and to compare the response to radiotherapy of the cell lines. To achieve these objectives we used cell lines HCC1806 and MCF7, representing the TN breast cancer and breast cancer that express HR, respectively. These cells were studied by immunocytochemistry (ICC) in order to evaluate their morphological characteristics, assess and confirm the expression of ER-α, PR, p53 and Ki-67. Both cell lines were subjected to mammosphere formation protocol. The first generation of mammospheres (MS1) was subsequently grown in adherent conditions (G1). This procedure was repeated twice to obtain the corresponding MS2, MS3, G2 and G3. With these cell populations total protein extracts were prepared and used to detect and quantify various proteins: ALDH, ER-α, ER-β, PR, HER-2 and p53. Moreover, cell lines HCC1806 and MCF7 were submitted to radiotherapy and their response assessed by the clonogenic assay.ICC revealed these cells have characteristics of aggressive tumor cells, being HCC1806 the more undifferentiated. Evaluation of the expression of ALDH, a common marker for stem cells, confirmed the CSC phenotype of cells submitted to the mammosphere forming protocol. There was also a difference in expression between MCF7 and HCC1806, wherein the latter has a higher expression which indicates a greater stemness. ER-α, PR and HER-2 are not expressed in HCC1806 and derived populations. The RE-β expressed in both cell lines was found to be diminished in the CSC, namely, MS1, MS2 and MS3. In the derived adherent populations G1, G2 and G3 there is an overlap with the original phenotype. This expression profile was also observed in MCF7 and derived adherent populations for ER-α, PR and HER-2 as well as P53. These results point to the profile of dedifferentiation of CSC which translates to a loss of the phenotypic characteristic and certainly has implications in clinical behavior of tumors. Regarding the response to radiotherapy, there was a greater susceptibility by triple negative cells. This response can, at least partially, be explained by the higher proliferative index by the triple negative cells. Breast cancer tumors are a heterogeneous disease. The CSC isolation and characterization is one decisive step in understanding the origin of cancer and the of response to therapy