Efeitos da radiação ionizante em linhas celulares de cancro do pulmão de não pequenas células : estudos in vitro

Dissertação de Mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.O cancro de pulmão (CP) é uma das principais causas de morte por cancro em todo o mundo. Em geral, o CP pode ser classificado em dois tipos: cancro do pulmão não-pequenas células (CPNPC) e cancro do pulmão de pequenas células (CPPC). O CPNPC inclui ainda os subtipos adenocarcinoma, carcinoma de pulmão de células escamosas e carcinoma de pulmão de células grandes, cada um com subtipos. Embora o número de estudos sobre CP seja muito elevado, a eficácia dos tratamentos ainda se encontra abaixo do ideal, contribuindo para tal uma ampla gama de fatores que afetam o resultado do tratamento. Avaliar os efeitos da radiação X (raios-X), em duas linhas celulares de CP após a irradiação de CPNPC (H1299 e A549) a nível da proliferação, viabilidade e tipo de morte celular. Para além disso estudaram-se alguns dos mecanismos envolvidos, o papel do stresse oxidativo, alterações no potencial de membrana mitocondrial (PMM), proteínas anti e proapoptóticas, citotoxicidade e ciclo celular. Os estudos foram realizados após as linhas celulares serem expostas a RX de 4MeV no acelerador linear Varian 600C 12D10. Em todos os estudos foram incluídas células controlo (ausência de radiação), sendo as células irradiadas com várias doses, entre 0,5 a 60Gy. A sobrevivência das células foi estudada recorrendo ao ensaio clonogénico durante 12 dias. O efeito da radiação a nível intracelular foi avaliado com recurso à citometria de fluxo (CF) após um período de incubação de 48 horas. A morte celular foi avaliada recorrendo à dupla marcação com Anexina-V (AV)/iodeto de propídio (IP). O ciclo celular foi estudado através de IP/RNase. Recorremos a anticorpos monoclonais conjugados com FITC para determinar a razão BAX/BCL-2. Para avaliar a expressão Da proteína P53 usámos a técnica de Western blot. Os níveis de stresse oxidativo, foram determinados por CF, nomeadamente o anião superóxido,peróxidos e níveis de glutationa reduzida recorrendo às seguintes sondas, Dihidroetídeo (DHE), 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) e alaranjado de mercúrio (1-(4-Chloromercuriophenylazo)-2-naphthol), respetivamente. Avaliámos ainda o PMM, utilizando a sonda fluorescente JC-1 (iodeto de 5,5’, 6,6’–tetracloro 1,1’, 3,3’–tetraetilbenzimidazolocarbocianina), por CF. Observámos uma diminuição na proliferação e da viabilidade celular dependente da dose, do tempo e da linha celular. O principal tipo de morte observado foi a apoptose. Os efeitos anti proliferativos e citotóxicos estão de acordo com o bloqueio de ciclo celular. No entanto, os nossos resultados demonstram que as células A549 são mais sensíveis à morte celular induzida por radiação, sendo que as células H1299 as mais resistentes. Estes resultados podem estar relacionados com diferenças na expressão da P53 e níveis de stresse oxidativo. Os resultados sugerem que a radiação X diminui a viabilidade celular e induz morte preferencialmente por apoptose. No entanto, a sensibilidade e/ou a resistência à radiação, poderá estar dependente das características moleculares do CP influenciando assim a resposta à radioterapia e, por conseguinte, o sucesso do tratamento.Lung cancer (LC) is one of the leading causes of cancer-related death worldwide. Classification and staging of LC are critical for definitive diagnosis, treatment strategy and to predict the patient’s outcome. Since 70% of patients are diagnosed in advanced stages, the pathologist has a crucial role in the classification of LC, for which the diagnosis is established by the histology and molecular analysis of biopsies collected from the involved place. In general, LC can be split into two main types: Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) and Small Cell Lung Cancer (SCLC). The NSCLC type includes adenocarcinoma, squamous-cell lung carcinoma, and large-cell lung carcinoma, each with its subtypes. Although the number of studies discussing lung cancer is vast, treatments efficacy is still suboptimal due to the wide range of factors that affect the patient’s outcome. To evaluate the effects of X radiation (X-rays), in two lung cancer cell lines after irradiation, two of non-small cell lung cancer (H1299 and A549 cells) namely in cell viability, proliferation and death. We also wanted to study some of the mechanisms involved, the role of oxidative stress and mitochondrial potential. The assays were performed after the cell lines were exposed to 4MeV RX in the Varian 600C Linear Accelerator 12D10. Assays included control cells (absence of radiation) and cells irradiated with various doses from 0.5 to 60 Gy. Cell survival was studied by clonogenic assay, plated immediately after radiation and incubated for 12 days (37oC, 5% CO2). Measurement of RX impact on intracellular activities was achieved by using flow cytometry (FC) after an incubation period of 48 hours. Cell death was evaluated using double staining with AnnexinV (AV)/ Propidium Iodide (PI). Cell cycle was performed with PI/RNase assay. By using FITC-conjugated monoclonal antibodies the quantity of BAX and BCL-2 was determined and subsequently a BAX/BCL-2 ratio was calculated. To evaluate OS was determined, by FC, thesuperoxide anion, peroxides and reduced glutathione levels using the probes, dihydroethidium, 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate and orange mercury, respectively. We also evaluate mitochondria membrane potential (MMP) by FC, using the fluorescent probe, 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl benzimidazolcarbocyanine. X-rays induces a decrease in cell proliferation and viability in a dose, time and cell line dependent manner, inducing cell death preferentially by apoptosis. These anti-proliferative and cytotoxic effects are in agreement with the observed cell cycle arrest. However, our results show that A549 is more sensitive to cell death induced by radiation than H1299 cells. These results may be related with differences in the p53 expression or stress oxidative response and could contribute to radiotherapy failure in this type of cancer. Our results suggest that X-rays leads to a decrease in LC cells viability inducing cell death mainly by initial apoptosis. However, the sensibility and/or resistance to radiation may be dependent on molecular LC characteristics which could influence the response to radiotherapy and consequently treatment success