Detection of Fusarium circinatum Nirenberg & O’Donnell in coniferous of the central region of Portugal

Dissertação de mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Numa altura em que a Floresta de Pinho em Portugal se encontra extremamente fragilizada pelo alastramento do nemátodo da Madeira do Pinheiro a todo o território continental, surge uma nova ameaça, o que tende a agravar o estado fitossanitário do Pinhal. Fusarium circinatum Nirenberg & O´Donnell (teleomorfo Gibberella circinata Nirenberg & O´Donnell), agente responsável pelo cancro resinoso do pinheiro, foi oficialmente assinalado em Portugal em Abril de 2008, num viveiro localizado na cidade de Anadia. O cancro resinoso afecta várias espécies de Pinus, tendo sido também observado em Pseudotsuga menziesii. Esta doença representa uma grande ameaça, pois provoca uma acentuada redução no crescimento e na qualidade da madeira e causa uma elevada taxa de mortalidade. F. circinatum foi considerado um organismo de quarentena em inúmeros países do mundo o que promoveu o desenvolvimento de ferramentas específicas para a detecção deste patogene. O trabalho aqui desenvolvido visava a deteção da presença de Fusarium circinatum em diferentes espécies de Pinus e Pseudotsuga menziesii provenientes da região centro de Portugal. Até Maio do presente ano foram recebidas um total de 85 amostras de Pinus sp. (com uma quantia variável de plantas). De cada amostra seleccionou-se um número representativo de plantas, dando especial atenção aos indivíduos que apresentavam sintomas. No caso de plantas aparentemente saudáveis a selecção foi feita ao acaso. Destas, foram recolhidos pequenos fragmentos (1cm de comprimento, 4 fragmentos por planta) nas áreas com lesões ou, no caso de plantas assintomáticas, do sistema radicular. Efectuou-se uma esterilização superficial destes pedaços com hipoclorito de sódio a 2% e posteriormente inocularam-se em PDA (potato dextrose agar) suplementado com 0,5 mg/ml de estreptomicina. Ao fim de 5 dias, todas as colónias visualmente identificadas como Fusarium foram isoladas em PDA e SNA (Spezieller Nährstoffarmer agar) e incubadas a 25ºC durante 10 dias. A identificação da espécie Fusarium circinatum foi feita primariamente com base no aspecto da cultura e em características morfológicas. Esta identificação foi confirmada por meio de PCR, onde foram utilizados primers específicos para esta espécie, CIRC1A/CIRC4A, resultando num fragmento de 360 pb da região IGS (Intergenic Spacer Region) do ADN ribossomal. Das 85 amostras, apenas 3 se mostraram positivas. O primeiro resultado positivo proveio de uma amostra colhida num viveiro onde o fungo já havia sido detectado e supostamente erradicado. O segundo foi isolado, pela primeira vez, de material vindo de um viveiro diferente. O 5 último teve origem numa plantação na qual foram utilizadas plantas doentes provenientes de um viveiro contaminado. Casos como estes acarretam graves consequências, quer em termos financeiros bem como a ameaça de uma espécie de grande valor, o que reforça a importância de uma atempada detecção e controlo da doença.At a time when the Portuguese Pine forest is extremely fragile due to the spread of the pine wood nematode through the entire continental territory, a new threat emerges which tends to worsen the phytosanitary condition of the forest. Fusarium circinatum Nirenberg & O´Donnell (teleomorph Gibberella circinata Nirenberg & O´Donnell), the casual agent of pitch canker disease, was officially reported in Portugal on April 2008 in a nursery located in Anadia. Pitch canker affects several species of the genus Pinus and is also reported to affect Pseudotsuga menziesii. This disease is a serious threat to pine forests wherever it occurs, by reducing growth and timber quality and causing extensive tree mortality. F. circinatum has been listed as a quarantine organism in numerous countries throughout the world, which prompted the development of specific tools for the detection of this pathogen. The purpose of this research is to detect the presence of Fusarium circinatum in Pinus spp. and Pseudotsuga menziesii from the central region of Portugal. Until May of the current year a total of 85 samples of Pinus sp. (each with a variable number of plants) were received. From each sample, a certain number of plants was selected to represent it, giving special attention to individuals displaying the symptoms. If no symptoms were observed the selection was made randomly. From the selected plants, small fragments were collected (1cm long, 4 pieces per plant) in the areas displaying lesions or in the case when no symptoms were observed, the fragments were removed from the root system. A superficial sterilization was performed using 2% sodium hypochlorite, and isolations were done on PDA (potato dextrose agar) supplemented with 0.5 mg/ml of streptomycin sulfate. After 5 days, the visually identified Fusarium species were isolated to obtain pure cultures on PDA and SNA (Spezieller Nährstoffarmer agar) and incubated at 25°C for 10 days. The species was identified as Fusarium circinatum on the basis of morphological and culture medium characteristics. The identification was confirmed by PCR with specific primers CIRC1A/CIRC4A, resulting in a 360 bp DNA fragment of the IGS (Intergenic Spacer) region of the rDNA. Out of the 85 samples, only 3 displayed signs of contamination. The first positive result belonged to a sample obtained in a nursery where the fungus had already been detected and supposedly eradicated. The second was isolated from the first time on a different nursery. The last one originated in a plantation where plants from a contaminated nursery were used. This situation carries severe consequences such 7 as great financial losses as well as a threat to a species of great value, which strengthens the importance of a timely detection and control of the disease