Ensaios de embriogénese somática e transformação genética em tamarilho (Cyphomandra betacea [Cav.] Sendt.)

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraO tamarilho (Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt sin. Solanum betaceum), pertencente à família das solanáceas, é uma árvore que produz frutos comestíveis com elevado valor nutricional. Alguns estudos têm mostrado o interesse desta espécie para a compreensão de aspectos particulares da morfogénese in vitro, particularmente a embriogénese somática (ES). A ES tem demostrado ser uma importante ferramenta na biotecnologia com um grande potencial para a rápida propagação de clones em larga-escala. Além disso, os procedimentos de transformação genética e criopreservação de muitas espécies vegetais, baseiam-se em protocolos eficazes de ES. Uma das formas de induzir ES no tamarilho consiste um processo em duas fases, no qual células embriogénicas são inicialmente induzidas num meio de cultura suplementado com uma auxina (fase de indução) e depois após a sua transferência para um meio de cultura desprovido de auxinas, desenvolvem-se embriões somáticos (fase de desenvolvimento). Vários tipos de explantes, com origem em material adulto ou previamente estabelecido in vitro, e várias condições de indução, têm sido testados para optimizar a resposta do tamarilho à indução de ES. Para superar o reduzido potencial de ES nos tecidos adultos, neste trabalho seguiu-se uma abordagem indirecta, na qual os rebentos de uma árvore adulta foram, primeiramente, estabelecidos in vitro, e uma abordagem directa, na qual se induziu ES em secções do caule de ramos jovens de tamarilho. De modo a optimizar o protocolo de indução de ES no tamarilho, precedeu-se à caracterização da resposta da indução de ES sob vários tipos de stresse, assim como face à indução de ES em diferentes genótipos, de plantas diploides e tetraploides, que foram previamente caracterizados citológica e morfologicamente. Os resultados demonstram que factores como o tipo de auxina, a concentração de sacarose, a presença de ácido ascórbico e o tempo de manutenção dos meios de cultura interferem na resposta à indução de ES. Na indução de ES em tamarilho, células embriogénicas e células não embriogénicas surgem lado a lado nos mesmos explantes, o que se trata de uma condição ideal para avaliar as alterações moleculares e bioquímicas observadas nos diferentes tipos de calos. No trabalho realizado estabeleceu-se, pela primeira vez, um protocolo para a multiplicação de massas de células embriogénicas através do uso de suspensões celulares. O teste de várias massas de células e vários volumes de meio de cultura permitiram analisar a cinética de crescimento das células e optimizar a razão x massa de células / volume a utilizar em ensaios futuros. Além disso, analisaram-se os perfis proteicos das secreções dos dois tipos diferentes de células, sendo as secreções do tecido não embriogénico as que apresentam mais diversidade e quantidade de proteínas. Este tipo de análise pode ser utilizada para compreender a embriogénese numa perspectiva mais integradora. Uma das muitas aplicações do calo embriogénico obtido por indução de ES é a transformação genética. Trabalhos anteriores para outras espécies têm demostrado que as taxas mais elevadas de sucesso na transformação genética têm sido obtidas com este tipo de explante. Neste trabalho procurou-se estabelecer um protocolo de transformação genéticas de células embriogénicas, utilizando três estirpes diferentes de Agrobacterium tumefaciens possuindo o plasmídeo p35SGUSINT. A quantificação da massa de células resistentes à canamicina e os resultados da coloração do ensaio GUS indicaram a estirpe C58C1,como a mais eficiente na transformação de células embriogénicas do tamarilho, sendo, no entanto, necessária uma análise mais detalhada em trabalhos futuros. A informação recolhida neste trabalho, nomeadamente com a análise comparativa da resposta de diferentes genótipos e com o desenvolvimento de um protocolo para a cultura de suspensões celulares, poderá contribuir para responder a alguns dos passos restritivos da ES e da transformação genética no tamarilho, para a qual os conhecimentos fundamentais sobre as plantas modelo tradicionais têm sido insuficientes. Encontrar as proteínas directamente envolvidas na aquisição de competência embriogénica poderá ajudar a compreender os mecanismos reguladores deste processo. Para além disso, o desenvolvimento de protocolos de transformação genética optimizados constitui um importante recurso, não apenas para o melhoramento da espécie, mas também como uma ferramenta da genómica funcional para a identificação e caracterização das vias moleculares envolvidas no processo de ES.Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt (tamarillo) (syn. Solanum betaceum) is a small solanaceous tree which produces edible high nutritional fruits. Several lines of research have shown the interest of this species to understand particular aspects of in vitro morphogenesis, in particular somatic embryogenesis (SE). SE is an important biotechnological tool with great potential for rapid large-scale clone propagation. In addition, genetic transformation and cryopreservation procedures in many plant species rely on efficient SE protocols. One of the pathways to induce SE in tamarillo is a two-step process in which embryogenic tissues and non-embryogenic callus are first produced (induction phase) in an auxin-rich medium and then developed into embryos, following the transfer to an auxin-free medium (development phase). Several explants, with origin from an adult tree or from plants previously established in vitro have been tested in optimization assays of the SE induction protocol in tamarillo. To overcome the lack of potential of adult tissues for SE, an indirect approach was attempted, in which shoots from an adult tree were first established in vitro, and a direct approach, in which SE was intended to be induced from juvenile plant material (intermodal stem segments). To improve the induction protocol of SE in tamarillo several stress conditions were tested for different genotypes of diploid and tetraploid plants. These genotypes were previously characterized cytological and morphologically. The results have showed that different factors, such as the auxin kind, the sucrose concentration, the presence of ascorbic acid on the medium and the medium´s maintenance time were crucial for the SE induction. In tamarillo SE, embryogenic and non-embryogenic cells arise side by side from the same cultured explants, which is an ideal condition to evaluate molecular and biochemical changes occurring in the different types of calli. In this work, a protocol for the embryogenic cells multiplication through cell suspension culture was established for the first time. Several weights of cells and several culture media volumes were tested in order to evaluate the kinetic growth of the cell suspension and optimize the ratio weight/volume for future approaches. Furthermore, protein profiles were obtained from the secretions produced by embryogenic and non-embyogenic cells after the culture period. The profiles analysis showed that the non-embryogenic cells were the ones producing a higher protein diversity and quantity. This type of analysis can be extended to understand embryogenesis in a more integrated perspective. xii One of the many applications for embryogenic tissue obtained by SE induction is its use for genetic transformation. Previous work with other species have reported the highest success levels achieved with this type of explant. In this work, the establishment of an efficient protocol for Agrobacterium-mediated transformation of embrygenic cells, using three different strains carrying the p35SGUSINT plasmid, was for the first time attempted. The quantification of kanamycin resistance cells and the results obtained for the Gus staining assay indicated that C58C1 was the most efficient strain, nevertheless more detailed analysis are needed for future assays. The information gathered in this work, with the comparative analysis of the responsiveness of different genotypes, under several culture conditions, and the development of a cell suspension culture protocol, can contribute to answer to some of the limiting steps of SE in tamarillo, to which fundamental knowledge from the classical model plants has been insufficient. Finding proteins directly involved in the acquisition of embryogenic competence may help to understand the regulatory mechanisms of this process. Furthermore, the development of optimized transformation protocols is critical, not only for the species improvement, but also for functional genomics approaches that would allow to better understand the molecular pathways involved in SE