Estudos de cultura in vitro em medronheiro (Arbutus unedo L.) aplicados ao seu melhoramento

Dissertação de mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal apresentada ao Departamento de Ciências da Vida.A espécie Arbutus unedo (Ericaceae) possui porte arbustivo ou arbóreo. O medronheiro é capaz de suportar temperaturas baixas (até -12ºC) e é tolerante à seca. Encontra-se largamente distribuído ao longo da bacia do Mediterrâneo, desde Espanha até à Turquia, algumas zonas do Norte de África e ilhas Mediterrânicas, e ainda na costa Atlântica, incluindo Irlanda e Portugal. O medronheiro tem várias aplicações: estabilização de solos, programas de reflorestação, floricultura e na produção de compota, geleia, aguardente mel e biomassa. Apesar de ser tradicionalmente uma espécie NUC (www.underutilized-species.org), o medronheiro tem também sido a aposta de vários agricultores, sendo actualmente reconhecida como uma espécie com elevado potencial. O presente trabalho insere-se num projecto mais alargado de melhoramento do medronheiro e é mais uma contribuição para um melhor conhecimento dos processos de propagação desta espécie. Foram estudadas diferentes técnicas de propagação: germinação de sementes, embriogénese somática, organogénese e multiplicação em meio líquido. Relativamente à germinação de sementes, a baixa percentagem de germinação pode ser contornada com pelo menos 14 dias de estratificação a 4ºC, obtendo-se assim percentagens de germinação próximas de 100%. Apesar de não assegurar a manutenção do genótipo, é uma técnica simples de aplicar. Em ralação à embriogénese somática, vários genótipos foram avaliados, não se tendo verificado diferenças na percentagem de indução. Os embriões somáticos passavam pelos estados de desenvolvimento típicos: globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar, embora com algumas variações relativamente a este padrão geral. Uma percentagem considerável dos embriões formados apresentava algum tipo de anomalia, o que pode comprometer o uso desta técnica para fins de propagação. Nos estudos relacionados com a organogénese, verificou-se que a multiplicação do medronheiro por esta técnica apresenta grande potencial, devido ao considerável número de plantas obtidas. No entanto, esta técnica deve ser alvo de estudos mais pormenorizados, de forma a perceber os mecanismos envolvidos e assim explorar todo o seu potencial. O crescimento em meio líquido de plantas de medronheiro revelou-se bastante eficaz na sua multiplicação, no entanto, o enraizamento das plantas obtidas foi muito reduzido. Assim, para que a técnica possa ser aplicada, esta limitação deve ser contornada. A estabilidade genética das plantas propagadas foi testada através de vi marcadores moleculares. Não se verificaram diferenças entre perfis, pelo que provavelmente não existem diferenças entre as plantas-mãe e as plantas in vitro testadas. No entanto, uma análise mais pormenorizada deve ser realizada. Nos ensaios de melhoramento, foram abordadas três técnicas distintas: polinização artificial, embriogénese polínica e poliploidização. No que diz respeito à polinização artificial, a germinação do pólen no estigma foi observada. Os tubos polínicos percorreram todo o comprimento do estilete em 20-24 h. Este resultado foi obtido nos ensaio realizados in vitro e in vivo, o que abre boas perspectivas para possíveis cruzamentos entre diferentes genótipos. Relativamente à embriogénese polínica, quando as anteras foram colocadas em cultura não se obtiveram embriões, mas sim calo que não revelou capacidade embriogénica. Foi também estabelecida uma relação entre a morfologia dos botões florais e o estado de desenvolvimento dos micrósporos, o que pode ser útil em futuras tentativas de obtenção de haplóides. Nos ensaios de poliploidização usou-se colquicina e orizalina. Os tratamentos com orizalina e em meio líquido foram mais agressivos para as plantas. Apesar de a ploidia das plantas obtidas não ter sido testada, verificou-se um crescimento reduzido, o que pode indicar diferenças na sua ploidia. Apesar de preliminares, os resultados obtidos abrem boas perspectivas no que diz respeito a diferentes técnicas de propagação do medronheiro. No entanto, para que possam ser utilizadas de forma efectiva na propagação em massa, alguns estudos mais detalhados terão de ser levados a cabo, no sentido de optimizar algumas das técnicas. No melhoramento do medronheiro, este trabalho representa um pequeno avanço. Os resultados da polinização artificial são especialmente interessantes, e permitirão a realização de um programa de cruzamentos de genótipos, no sentido de obter variedades com características vantajosasArbutus unedo (Ericaceae) is a small shrub or tree that can stand low temperatures (until -12ºC) and is tolerant to water stress. This species is spread around the Mediterranean basin, from Spain to Turkey, some areas in the North Africa and Mediterranean islands, and also in the Atlantic coast, including Ireland and Portugal. The strawberry tree has innumerous applications such as soil stabilization, reforestation programs, floriculture, and production of jams, spirits, honey and biomass. Although being traditionally considered a NUC species (www.underutilized-species.org), the great interest recently shown by farmers and other stakeholders has increased the potential of this tree. The present work is part of a more broad project which the main goal is the improvement of strawberry tree. Different propagation techniques were studied: seed germination, somatic embryogenesis, organogenesis and multiplication in liquid medium. The results concerning seed germination showed that the rates were low. However, stratification at 4ºC (for at least 14 days) increased germination to values close to 100%. Although this technique does not assure propagation of selected trees it is easy to apply and can be used to increase variability and to better germinate hybrid seeds between genotypes. Somatic embryogenesis induction was tested in different genotypes, and no significant differences were observed. In spite of some variations, somatic embryo morphology was similar to the general pattern, going through globular, hearth, torpedo and cotyledon stages. A considerable rate of abnormal somatic embryos was observed which can compromise the use of this technique for propagation purposes. The propagation of the strawberry tree through organogenesis has a great potential since a large number of plants can be obtained. However, more work must be carried out before it can be used for propagation purposes. The results also showed that strawberry tree plants can be propagated in liquid medium opening the way for the use of bioreactors. However, these plants were difficult to root. Therefore, this limitation must be overcome, in order to apply this technique for propagation purposes. The genetic stability of propagated plants was tested, and no differences were found between the mother plants and the in vitro propagated plants. Nevertheless, a more detailed analysis must be carried out with more primers and more plants. viii Regarding plant breeding, three different techniques were used: artificial pollination, pollen embryogenesis and polyploidization. Concerning the artificial pollination, pollen germination in stigma was observed and the growth of the pollen tubes through the style occurs in 20-24 h. This result was obtained not only in vitro but also in in vivo pollinations, which offers good perspectives to control artificial hybridization. With regard to pollen embryogenesis, callus were obtained but without embryogenic or organogenic potential. A relation between flower buds and microspore development stage was established which may be useful in further attempts to obtain haploids through microspore culture. In polyploidization assays, colchicine and oryzalin were used. The treatments with oryzalin and liquid medium were showed to be more aggressive to the plants. Although the ploidy level was not assessed, a low growth rate was observed, which can indicate different ploidy levels among the plants. These preliminary results opened new ways of research for the breeding of Arbutus unedo and are one more contribution to the study of this species. However, in order to use these techniques for mass propagation, mores studies must be carried out. The pollination results are especially interesting, for future crossbreeding assays and for the obtention of plants with new characteristics