Preparação e Caracterização de Hidrogéis de Quitosano para Administração por Via Injetável

Tese de doutoramento em Engenharia Química, apresentada ao Departamento de Engenharia Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraPara além da capacidade de reter grandes quantidades de água, os hidrogéis apresentam propriedades muito atrativas para aplicações na área biomédica e farmacêutica, designadamente a capacidade para mimetizar os tecidos naturais, bem como propriedades mecânicas e velocidade de degradação ajustáveis e facilidade de aplicação através de meios minimamente invasivos, por exemplo, a injeção. Adicionalmente, um hidrogel injetável passível de ser formado in situ deve apresentar um mecanismo de transição sol-gel adequado para aplicações clínicas, ou seja, deve ser inicialmente líquido, de modo a facilitar a injeção e a distribuição homogénea de células, ou do princípio ativo, e ser capaz de gelificar rapidamente, sob condições fisiológicas, após injeção. Os hidrogéis de base quitosano destacam-se pela sua variedade, versatilidade e propriedades intrínsecas (biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade). Vários métodos têm sido usados para preparar hidrogéis de quitosano, como seja a reticulação física, baseada em interações iónicas e/ou secundárias, ou a reticulação química que usa a ligação covalente para unir as cadeias poliméricas. Embora os sistemas reticulados fisicamente tenham como principal vantagem a formação do hidrogel à temperatura do corpo humano, apresentam algumas desvantagens, designadamente a fraca estabilidade estrutural e reduzidas propriedades mecânicas. Em contrapartida, os sistemas reticulados por via química exibem melhores propriedades mecânicas e elevada estabilidade, estando a sua principal limitação normalmente relacionada com a toxicidade dos agentes reticulantes. No presente trabalho pretendeu-se preparar um sistema injetável de base quitosano para transporte e libertação de fármacos, capaz de ser produzido in situ, em condições fisiológicas de temperatura e de pH, recorrendo a um mecanismo de reticulação combinado (co-reticulação), usando como reticulante físico, o sal fosfato dissódico de glicerol, e como reticulante químico, o genipin. Deste modo, pretendeu conjugar-se as vantagens de cada um dos dois tipos de reticulação, nomeadamente a termossensibilidade conferida pela reticulação física e a estabilidade estrutural resultante de redes reticuladas quimicamente. Numa primeira fase, caracterizou-se exaustivamente o sistema co-reticulado. As propriedades morfológicas, estruturais e mecânicas, o controlo do tempo de gelificação, a taxa de degradação, a capacidade de intumescimento e a citotoxicidade dos hidrogéis foram alguns aspetos considerados relevantes para a caracterização do hidrogel enquanto sistema injetável para transporte e libertação de fármacos. O estudo do efeito da concentração do reticulante químico foi outro tópico igualmente analisado. Além disso, o comportamento/propriedades do sistema co-reticulado foi sempre confrontado com o resultante do processo de reticulação puramente física. Numa segunda fase, testaram-se as potencialidades dos hidrogéis desenvolvidos para a libertação de fármacos, designadamente de um antitumoral - a cisplatina. Foram usadas diferentes estratégias para incorporar a cisplatina nos hidrogéis. Primeiramente incorporou-se o fármaco, na forma livre, por dissolução diretamente na matriz polimérica. De seguida, e com o intuito de prolongar no tempo a libertação do agente terapêutico, procedeu-se à incorporação no hidrogel de sistemas de libertação independentes contendo o fármaco pré-encapsulado, designadamente lipossomas e microesferas. Por último, realizou-se um estudo experimental in vivo, em modelo animal, para avaliar a formação e a permanência dos hidrogéis no local de injeção. Foi também avaliada a resposta inflamatória dos tecidos aos implantes no local de implantação, através de análise macroscópica e análise histológica, após 7 e 30 dias de evolução. O sistema de libertação aqui proposto, baseado na matriz co-reticulada, é inovador, tendo, tanto quanto é do nosso conhecimento, sido desenvolvido e caraterizado pela primeira vez no presente trabalho. Os resultados mostraram que a metodologia desenvolvida conduziu à formação efetiva de um hidrogel de quitosano co-reticulado, à temperatura de 37 ºC e a pH neutro, ou seja, em condições fisiológicas. A característica mais atrativa dos hidrogéis co-reticulados reside na sua capacidade de poderem ser administrados por via injetável, uma vez que são líquidos à temperatura ambiente, e de produzirem estruturas sólidas, altamente porosas, in situ. A adição de genipin (em diferentes concentrações) revelou-se capaz de modificar o processo de gelificação das soluções de quitosano neutralizadas, designadamente o tempo de gelificação e as propriedades viscoelásticas, tendo-se refletido, também, em alterações nas propriedades morfológicas, estruturais e mecânicas dos géis resultantes. Além disso, a presença do reticulante químico melhorou as propriedades viscoelásticas dos géis relativamente ao sistema reticulado fisicamente, e o aumento da sua concentração induziu um reforço das propriedades mecânicas do sistema co-reticulado. Ficou, ainda, demonstrado na presente investigação que propriedades do quitosano, como sejam a biodegradabilidade, a ausência de toxicidade e a elevada capacidade de absorção de água, não se perdem com a co-reticulação dos hidrogéis. Dos estudos de libertação ficou igualmente demonstrado que, na presença da enzima que atua diretamente na degradação do quitosano (a lisozima), a libertação de cisplatina ocorre de forma contínua e prolongada ao longo do período de teste (quatro semanas). Mais, a conjugação do tipo de reticulação (física e físico-química) e do modo de incorporação do fármaco (disperso na matriz ou encapsulado em lipossomas ou microesferas) permitiu obter perfis de libertação distintos que poderão ser combinados por forma a obter o perfil de libertação desejado para uma dada terapêutica. O estudo in vivo mostrou que as formulações poliméricas líquidas, injetadas subcutaneamente em ratos da linhagem Wistar, produziram os respetivos hidrogéis nos locais de injeção. A análise histológica revelou, após uma semana de evolução, uma acentuada resposta inflamatória, provavelmente, relacionada com o processo de degradação das matrizes, enquanto que aos 30 dias foi notória uma aparente diminuição do volume ocupado pelo material, bem como um decréscimo de células inflamatórias e um predomínio de macrófagos, linfócitos e plasmócitos. Face aos resultados apresentados, os hidrogéis desenvolvidos na presente investigação demonstram elevado potencial para aplicações que requeiram libertação prolongada e localizada de cisplatina.In addition to the ability to retain large amounts of water, hydrogels exhibit very attractive properties for application in the biomedical and pharmaceutical fields, in particular the ability to mimic natural tissues, mechanical properties and degradation rates liable to be modulated, and especially the possibility of being applied by minimally invasive means as, for example, injection. Moreover, injectable hydrogels must present sol-gel transition mechanisms suitable to clinical purposes, i.e., must be initially in liquid form, to facilitate injection and to enable the homogeneous distribution of cells or drugs, and should quickly turn into gel under physiological conditions after implantation. Chitosan-based hydrogels are known by their versatility and intrinsic properties (biocompatibility, biodegradability and non-toxicity) and have been prepared by various methods, namely physical cross-linking, based on ionic and/or secondary interactions, and chemical cross-linking using covalent bonding to attach the polymeric chains. Although physically cross-linked systems can be produced under mild conditions, the resultant matrices present disadvantages as poor stability and weak mechanical properties. The chemically cross-linked systems exhibit, on the contrary, superior performance regarding these properties, the main limitation being, however, the toxicity of most of the cross-linking agents used. The main purpose of the present study was to prepare an injectable chitosan-based system, able to be produced in situ under physiological conditions of temperature and pH, using a combined cross-linking mechanism (referred to herein as co-cross-linking), with glycerophosphate disodium salt and genipin, respectively as physical and chemical cross-linking agents. The idea is to combine the advantages of each of these two types of cross-linking, i.e., the thermosensitive of physical cross-linking and the stability of chemically cross-linked networks. Firstly, the co-cross-linked hydrogels have been fully characterized having in mind their eventual application for local drug delivery. Parameters like mechanical and structural properties, gelation time, degradation rate, swelling ability and cytotoxicity, most relevant in injectable hydrogels, have been investigated. The effect of the concentration of the chemical cross-linking agent has been also studied. The behavior/properties of the co-cross-linked systems have been always confronted with the results of the purely physical cross-linking process. Following, we analyzed the potential of hydrogels as drug release carriers of an antitumor agent such as cisplatin. Different strategies were used to encapsulate cisplatin in hydrogels. First, the drug was incorporated in its free form, by direct dissolution in the polymer matrix during its preparation. Next, with the purpose to increase the release time of the therapeutic agent, the drug was pre-encapsulated in liposomes and microspheres, further added to polymer solution. Finally, we carried out an in vivo study to assess the formation and retention of hydrogels at the injection site. We also assessed the inflammatory response at the site of implantation, through macroscopic and histological analysis after 7 and 30 days of evolution. The delivery system developed, which is based on a co-cross-linked matrix, is innovative, and, to the best of our knowledge, has never been tested and characterized. The results show that this strategy of combining chemical and physics mechanisms allows the formation of a co-cross-linked chitosan based hydrogel at a temperature of 37 ºC and neutral pH, corresponding to physiological conditions. However, probably the most attractive feature of the co-cross-linked hydrogels produced is their ability to be administered by injection, since they are liquids at room temperature, forming highly porous and solid structures in situ. The addition of genipin proved capable of modifying the gelation process of the neutralized chitosan solution affecting both the gelation time and the viscoelastic properties. Simultaneously changes in morphological, structural and mechanical properties of the resulting gels were observed. As expected, the use of chemically cross-linking mechanism has improved the viscoelastic properties of the hydrogels when compared to the system obtained using only physical cross-linking. Furthermore, the increase of genipin concentration induced the reinforcement of the mechanical properties of the co-cross-linked system. Results also demonstrated that properties of chitosan, such as biodegradability, absence to toxicity and swelling capacity, are preserved in the co-cross-linking of hydrogels. Drug release studies carried out using the various hydrogels also show that the presence of lysozyme, the enzyme that acts directly on the degradation of chitosan matrices, has a relevant impact on the release profile. It was found that, in lysozyme environments, the release of cisplatin is sustained over the test period (four weeks). Furthermore, the combination of the cross-linking mechanisms (physical or physic-chemical) and the method used to incorporate the drug in the gel (directly dispersed in the matrix or previously encapsulated in liposomes or microspheres subsequently dispersed in the matrix) allow to obtaining different release profiles. These methodologies can thus be combined to obtain a specific release profile, suitable for a given therapy. The in vivo study confirmed that the liquid polymer formulations subcutaneously injected in Wistar rats produced the hydrogels at injection sites. Histological analysis of tissues revealed, after a week, a strong inflammatory response, probably related to the degradation process of the chitosan matrix. After 30 days an apparent decrease in the volume occupied by the material as well as a decrease in the intensity inflammatory cells and predominance of macrophages, lymphocytes and plasma cells was observed. From all the above results, it can be concluded that the hydrogels developed in this research work show great potential as drug release carriers for applications requiring in situ administration and sustained release of cisplatin