Desequilíbrios genómicos nas patologias do desenvolvimento e do comportamento

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde (Pré-Bolonha), ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraA citogenética convencional desde a década de 1970 que se tornou uma técnica fundamental no diagnóstico de alterações cromossómicas numéricas e estruturais. Esta área da genética clínica proporciona um diagnóstico em 10-15% dos pacientes com perturbações do neurodesenvolvimento, em particular o défice intelectual (DI), as perturbações do espectro do autismo (PEA) e malformações congénitas (MC). Contudo, a sua capacidade de resolução não vai além das 3-10 Mb, mesmo com bandas de alta resolução. Com a introdução das técnicas de citogenética molecular, a Fluorescence in situ Hybridization (FISH) e mais tarde a Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), foi possível alargar o leque de diagnósticos a um maior nível de resolução, aumentando o número de desequilíbrios genómicos identificáveis em aproximadamente 5% dos pacientes, com particular relevância no caso das síndromes de microdeleção e microduplicação e nos rearranjos das regiões subteloméricas. Nos últimos anos a introdução das metodologias de array-based Comparative Genomic Hybridization (array-CGH) tornou possível fazer a análise de todo o genoma numa só experiência mas com uma resolução até 100 vezes superior à citogenética convencional, dependendo da capacidade de resolução da plataforma utilizada. Surge assim uma nova escala de detecção dos desequilíbrios genómicos, passando-se do número de cópias de um cromossoma (aneuploidia) ou da duplicação e deleção de segmentos cromossómicos microscópicos para a detecção de desequilíbrios envolvendo segmentos genómicos submicroscópicos, que podem ser menores que 100 Kb e denominados de Copy Number Variants (CNVs). Abriram-se assim novas perspectivas para a procura da etiologia dos distúrbios do neurodesenvolvimento, como o DI e o PEA, assim como para as malformações congénitas. Com a aplicação das técnicas de array-CGH em grandes grupos de pacientes tem sido possível estabelecer recentemente novas síndromes de microdeleção e microduplicação, construir bases de dados para recolha, organização e comparação das CNVs identificadas e do seu significado clínico. Os desafios e dilemas de interpretação da causalidade de algumas cromossomopatias estenderam-se à escala das CNVs, sendo imperativo interpretar com clareza, determinando as que constituem variantes benignas ou polimórficas, as que são patogénicas e as que permanecem de significado clínico incerto (SCI). Para atingir este objectivo é determinante que o laboratório tenha acesso a uma caracterização clínica detalhada, que permita uma boa correlação genótipo-fenótipo. Neste trabalho um grupo de 147 pacientes com DI, PEA e/ou MC, foi avaliado utilizando uma plataforma de array-CGH com oligonucleótidos, determinando-se a prevalência de CNVs benignas (polimórficas), patogénicas ou de significado clínico incerto. Estabeleceu-se um algoritmo com critérios claros de avaliação e interpretação do significado clínico das CNVs identificadas. Em seis pacientes com desequilíbrios microscópicos, diagnosticados pela citogenética convencional, a caracterização por array-CGH revelou-se fundamental na identificação do conteúdo génico envolvido, na reclassificação do rearranjo, em dois pacientes, e detectou uma nova CNV patogénica envolvida no fenótipo em outros dois. Nos outros 141 pacientes, 22 revelaram uma CNV submicroscópica classificada como patogénica (15,6%) e em 34 pacientes apenas se observaram CNVs de SCI (24,1%). No grupo das CNVs patogénicas submicroscópicas, 50% correspondem a microdeleções ou microduplicações recorrentes em regiões de síndromes já estabelecidas, a outra metade foi classificada como patogénica pelo seu conteúdo génico e ou pacientes sobreponíveis já reportados. Com este trabalho sai reforçada a estratégia de aplicação da array-CGH como teste de primeira linha no diagnóstico de pacientes com distúrbios do neurodesenvolvimento e MC, quando não existe uma orientação clínica específica. Inverte-se a estratégia laboratorial passando a FISH e a MLPA ou mesmo a citogenética convencional para uma segunda etapa de caracterização do rearranjo e/ou avaliação dos progenitores por vezes portadores equilibrados. As novas técnicas de sequenciação denominadas por Next Generation Sequencing (NGS) irão eventualmente substituir a array-CGH no diagnóstico dos distúrbios do neurodesenvolvimento e MC. A sequenciação massiva tem a capacidade de detectar mutações pontuais assim como deleções, duplicações mas também rearranjos equilibrados como translocações e inversões. No presente, sequenciar todo o genoma é exequível, mas muito dispendioso, em poucos anos será financeiramente comportável e talvez mais aplicável em larga escala. Contudo, será necessária uma evolução ao nível bioinformático de modo a resolver alguns impasses relacionados com a aplicação da NGS. A interpretação do grande número de novas variantes que serão identificadas será um desafio enorme para cientistas e clínicos, com a necessidade de integração concertada do genótipo com o fenótipo. Palavras-chave: array-CGH, citogenética, défice intelectual, neurodesenvolvimentoConventional karyotyping has been used as the standard technique since the 1970s in the diagnosis of numerical and structural chromosomal aberrations. This area of clinical genetics gives a diagnosis in 10-15 % of the patients with neurodevelopment disorders, including intellectual disability (ID), autism spectrum disorders (ASD) and congenital malformations (CM). However, conventional karyotyping usually only detects rearrangements larger than 3-10 Mb, even in high resolution banding. With the development of molecular cytogenetics, the Fluorescence in situ Hybridization (FISH), and the Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), it was possible to detect a larger number of genomic imbalances with a high resolution, increasing the detection rate in 5 % of the patients, particularly in the diagnosis of microdeletion and microduplication syndromes and subtelomeric rearrangements. In recent years with the introduction of array-based Comparative Genomic Hybridization (array-CGH) techniques it became possible to screen the whole human genome in a single experiment with an increasing resolution that can be 100 times higher than conventional karyotyping, depending on the resolution of the array. Genomic imbalances can be detected with a higher resolution, starting in the copy number of a chromosome (aneuploidy) or the duplication and deletion of microscopic chromosome segments and achieving the detection of submicroscopic genomic imbalances, even smaller than 100 kb, the Copy Number Variants (CNVs). The etiology of neurodevelopment disorders including ID, ASD and CM, has new perspectives of diagnosis. Since the application of array-CGH in large cohorts of patients, it was possible in recent years to establish new microdeletion and microduplication syndromes and to construct databases with the collection of the identified CNVs allowing the comparison of its clinical significance. The challenges and dilemmas of the interpretation of genomic variation in cytogenetics extend to the resolution of the CNVs size, being essential to determine which CNVs are benign or polymorphic, which are pathogenic and which remain unclassified variants with uncertain clinical significance. To achieve this goal it is very important that it is provided to the laboratory a detailed clinical characterization, for an ascertain genotype-phenotype correlation. In the present work a group of 147 patients with ID, ASD and CM, was evaluated using oligonucleotide array-CGH, in order to ascertain the prevalence of benign (or polymorphic) CNVs, pathogenic or CNVs of uncertain clinical significance. An algorithm with clear criteria of evaluation and interpretation of the clinical significance of the identified CNVs was established. In six patients with previous identified microscopic rearrangements, the characterization by array-CGH was essential to identify the genes involved, leading to the re-classification of the type of rearrangement in two of the patients and disclosing a new pathogenic CNV involved in the phenotype in two other ones. In the other 141 patients, 22 revealed a submicroscopic CNV classified as pathogenic (15,6%) and in 34 patients were only identified CNVs of uncertain clinical significance (24,1%). In the group of the submicroscopic pathogenic CNVs, 50% were recurrent microdeletions or microduplications in regions of previous established syndromes, the other half were classified as pathogenic because of its genic content and/or previous overlapping reports. With this work the use of array-CGH as the first tier diagnostic technique of patients with neurodevelopment disorders and CM, when there isn’t a specific clinical orientation, is reinforced. The strategy of the laboratory investigations is now inverted, FISH and MLPA techniques or even conventional karyotyping could be a second step in the investigation when it is needed the characterization of the rearrangement involved and the screening of the parents that could be balanced carriers. Next Generation Sequencing (NGS) technologies will eventually replace the array-CGH in the genetic diagnosis of neurodevelopment disorders and CM. Massive sequencing will be able to detect mutations as well as deletions, duplications, and balanced rearrangements like inversions and translocations. At the moment sequencing the whole genome is feasible, but an expensive strategy, probably in a few years it will be affordable and maybe suitable for a large scale. However, several bioinformatics advances will be necessary to solve some issues related with NGS. The interpretation of a large number of new variants will be a huge challenge for scientists and clinicians, that will need to collaborate to achieve a good integration of the genotype and the phenotype. Keywords: array-CGH, cytogenetics, intellectual disability, neurodevelopmen