Long non-coding RNAs at the service of p53

A instabilidade genómica é uma propriedade fundamental subjacente ao processo de carcinogénese, uma vez que confere às células cancerígenas a capacidade para a sua expansāo clonal. A aquisiçāo de um genótipo mutante permite nāo só a expansāo destas células, assim como, a manipulaçāo do ambiente em que estāo inseridas. O genoma possui, no entanto, sistemas de vigilância que detetam e corrigem defeitos na cadeia de DNA. O gene supressor tumoral TP53, mutado em cerca de metade de tumores humanos, é um fator de transcriçāo considerado o ‘guardiāo do genoma’ (Lane, 1992). A ativaçāo multifactorial do gene TP53, que atua via induçāo da transcriçāo de diferentes genes-alvo, classicamente culmina na paragem do ciclo celular, senescência e/ou apoptose das células cancerígenas. Até recentemente, era considerado que a extensa rede de genes-alvo regulada pelo gene p53 era composta apenas por genes codificadores de proteínas. No entanto, tem sido cada vez mais aceite, que os genes codificadores de proteínas regulados pelo p53 nāo sāo causa suficiente para explicar o seu amplo papel como supressor tumoral (Brady et al., 2011). O desenvolvimento de novas técnicas de sequenciação de última geração veio revelar nāo só que a maior parte do genoma de eucariotas é composto por DNA nāo codificante, mas também que estas regiões sāo transcritas numa nova classe de reguladores genómicos, os long non-coding RNAs (lncRNAs). O termo enhancer RNAs, uma classe de lncRNAs transcritos apartir de enhancers (em inglês) e reguladores da expressão génica, foi correlacionado com a expressāo positiva de genes-codificantes de proteínas localizados nas imediações da regiāo nāo-codificante (Kim et al., 2010). Sendo assim, formulamos a hipótese de que o p53 exerça parte da sua actividade reguladora via interaçāo com domínios produtores de enhancer-RNAs. Recorremos à técnica de genome-wide chromatin-binding profiles para testar a nossa hipótese e descobrimos regiões-genómicas ligadas a p53, mas que se localizam a grandes distâncias em relaçāo a qualquer um dos genes-alvo de p53. A análise destas regiões permitiu identificar a presença de elementos conservados de ativaçāo de p53 em domínios epigeneticamente caraterizados como enhancers. Nestas regiões, que designámos de p53-bound enhancer regions (p53BERs), constatámos que sāo produtoras de eRNAs, em resposta à activaçāo de p53. O nosso estudo demonstrou também que os p53BERs aumentam a transcriçāo regulada pelo p53 através de interacções intra-cromossómicas com múltiplos genes-vizinhos. Adicionalmente, mostrámos nāo só que uma das funções dos eRNAs consiste no aumento da transcriçāo mas também na relevância do papel dos eRNAs na resposta regulada pelo p53 (Melo et al., 2013). No seguimento dos nossos resultados, mapeámos todos os enhancers regulados pelo p53 (p53RERs, em inglês) e descobrimos que, enquanto a maioria dos enhancers induzidos por p53 possuem domínios de ligaçāo ao p53 (p53BERs, em inglês), na sua maioria estes domínios estão ausentes (p53FERs, em inglês) o que sugere um modelo de activaçāo diferente. De facto, observámos que para um subconjunto de p53RERs é necessária a presença de um lncRNA activado pelo stress, que denominamos por LED (lncRNA activator of enhancer domains). Demonstrámos que o LED é um factor-alvo de p53 e é importante para a deposiçāo do marcador epigenético de acetilação da histona 3 na lisina 9 (H3K9ac, em inglês) (um marcador de enhancer) no subconjunto de p53RERs. A presença de LED é indispensável para a correcta paragem do ciclo celular, induzida pelo p53. Finalmente, detetamos a presença de LED em diversas linhas celulares cancerígenas e tumores humanos. O trabalho desenvolvido nesta Tese demonstra que os lncRNAs representam elementos funcionais do genoma não-codificante e que desempenham um papel crucial na biologia do cancro, podendo vir a ser utilizados em futuras abordagens terapêuticas.Underlying the multiple steps characteristic of cancer progression is genomic instability, as it provides the requirements necessary for the selective clonal advantage of cancer cells. The acquisition of a mutant genotype allows the outgrowth of these cells and manipulation of their local environment. However, the genome possesses efficient surveillance systems to detect and resolve defects in the DNA. The tumor suppressor gene TP53, which was found to be mutated in about half of all human cancers, represents a known transcription factor often referred to as the “guardian of the genome” (Lane, 1992). The multifactorial activation of p53 results in a complex transcriptional response that classically culminates in: cell cycle arrest, senescence and/or a programmed cell death (apoptosis), achieved through the regulation of different target genes. Until recently, the p53 transcriptional network mainly revolved around its protein-coding target genes. However, it has been increasingly recognized that the thus-far known protein-coding p53 target genes cannot fully explain its tumor suppression activity (Brady et al., 2011). The advent of next-generation sequencing techniques unraveled the existence of a large portion of non-coding elements in the genome. These elements can be transcribed into a new class of genomic regulators, the long non-coding RNAs (lncRNAs). The expression of enhancer RNAs (eRNAs), a class of long ncRNAs transcribed from enhancer elements that regulate gene expression, was show to positively correlate with nearby protein-coding genes (Kim et al., 2010), which led us to hypothesize that part of the p53-regulatory network could be mediated through its interaction with enhancer-RNA producing domains. For that, we used genome-wide chromatin-binding profiles and discovered p53-bound genome regions located far from any known p53 target gene. These regions essentially revealed, the presence of conserved p53 response elements and presented hallmarks of enhancer domains. We named these new elements as p53-bound enhancer regions (p53BERs), and observed the production of eRNAs in response to p53 induction. Our study further demonstrates that p53BERs enhance p53 transcriptional response accomplished through intra-chromosomal interactions with multiple neighboring target genes. Additionally, we provide evidence concerning the functionality of eRNAs in the enhancement of transcription and demonstrate the importance of these new RNA molecules required for a proper p53 response (Melo et al., 2013a). We then set out to globally map all p53-regulated enhancers (p53RERs) and found that while many p53-induced enhancers contained p53-binding sites (p53BERs), most did not (p53-free enhancer regions, p53FERs), suggesting a different mode of activation. Indeed, we were able to observe that for a subset of p53RERs the presence of a stress-activated lncRNA, termed LED (lncRNA activator of enhancer domains), is required. We show that LED is a direct p53-target that is important for the deposition of histone 3 lysine 9 acetylation (H3K9ac) (a transcriptional active enhancer mark) at a subset of p53RERs. Furthermore, LED’s presence is indispensable for a proper p53-induded cell-cycle arrest. Finally, we uncover the promoter-associated hypermehtylation of LED in several cancer cell lines and human tumors. The findings in this thesis provide evidence that lncRNAs represent functional elements embedded in the non-coding portion of our genome. We show that these newly emerging RNA molecules are important players in cancer biology, and can be a future therapeutic approach in the fight against cancer