Characterization of antibodies recognizing pathological forms of Tau in Alzheimer’s disease

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular (Neurobiologia) ,apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraAlzheimer’s Disease is a critical neurodegenerative disease characterized by two hallmarks, deposition of Aβ protein in plaques and incorporation of Tau proteinaceous aggregates in neurofibrillary tangles(Braak et al., 2011; Huang and Mucke, 2012). Biomarkers detecting alterations in mechanism of this disease are of utmost importance to understand disease progression (Blennow and Hampel, 2003) Major breakthroughs have been made in the comprehension of the mechanisms of AD and potential therapies; there are however no effective disease modifying treatments of the disease(Huang and Mucke, 2012). Progress in many fields like chemistry, radiology and systems biology are continuously providing tools giving new possibilities to develop new therapy approaches with many different strategies(Huang and Mucke, 2012). One of AD critical alterations is Tau hyperphosphorylation and aggregation in paired helical and straight filaments, condensing in neurofibrillary tangles. The development of these aggregates is associated with the progression of neuronal loss and cognitive decline (Chai et al., 2011), therefore, hyperphosphorylated Tau targeting by immunotherapy is one of many promising approaches to treat AD. Previous studies evidenced that Tau immunization prevents aggregation and attenuates functional impairments in mouse models (Chai et al., 2011). To have a better insight on therapeutic effect of a pharmacological agent, it is of great importance to have efficient biomarkers of AD, that can detect if there is any alteration on the levels of a determined protein due to the effect on a specific target (Blennow and Zetterberg, 2012; Hampel et al., 2010). One of the goals of this project was to characterize antibodies generated against different forms of Tau, both pathological and normal. Characterization of the antibodies was performed and a better knowledge of the library of antibodies in study was obtained. Antibodies reacting with pathological form of Tau were identified, there were antibodies epitopes that could be determined, and the knowledge on the reactivity of these antibodies against normal Tau vs. phosphorylated was obtained. The reactivity of these antibodies against Tau from different species was also obtained. Other goal of this project was to develop specific assays reacting with dog Tau, an important pre-clinical longitudinal pharmacokinetic model, that shows age related alterations in the brain and cognitive decline(Head, 2013). With the knowledge obtained from the antibodies characterization it was possible to identify assays that could detect Tau protein in dog CSF. The possibility to detect specific regions of Tau protein in a sensitive way can have great importance for research and therapeutics development in AD.A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa caracterizada por duas principais características, o deposito de placas de proteína Aβ e a incorporação da agregados proteicos de proteína Tau em tranças neurofibrilares (Braak et al., 2011; Huang and Mucke, 2012). Biomarcadores que consigam de uma forma especifica detectar alterações associadas à patologia são importantes para compreender a progressão da doença (Blennow and Hampel, 2003) Descobertas importantes tem sido feitos na compreensão e conhecimento dos mecanismos, e possível terapia desta doença, não existindo porem actualmente nenhum fármaco que consiga modificar a progressão da doença (Huang and Mucke, 2012). Avanços em diversas áreas, tais como a química, radiologia, e biologia de sistemas tem constantemente providenciado ferramentas que podem ser aplicadas no desenvolvimento de novas terapias com diferentes estratégias (Huang and Mucke, 2012). Uma das alterações críticas da doença de Alzheimer e a hiperfosforilação e consequente agregação da Tau em em filamentos helicoidais emparelhados e lineares, que se condensam em tranças neurofibrilares. O desenvolvimento destes agregados está associada com a progressão da perda neuronal e declínio cognitivo, portanto, imunoterapia que tenha como alvo a proteína Tau no seu estado hiperfosforilado é uma de muitas possíveis terapias promissoras contra a doença de Alzheimer (Chai et al., 2011). De modo a ter uma compreensão nos efeitos terapêuticos de um agente farmacológico é de suma importância ter biomarcadores que eficientemente consigam detectar alterações de níveis de uma determinada proteína associada com um efeito no alvo pretendido (Blennow and Zetterberg, 2012; Hampel et al., 2010). O objectivo principal deste projecto foi o de caracterizar anticorpos gerados a partir de diferentes formas de Tau, tanto patológica, como normal. A caracterização destes anticorpos foi feita e um melhor conhecimento do conjunto de anticorpos em estudo foi obtido. Anticorpos que mostram reactividade contra formas patológicas de Tau foram identificados, houve também epitopos de determinados anticorpos que foram determinados. A reactividade destes anticorpos contra Tau normal ou Tau fosforilada foi também definida, bem como a reactividade contra diferentes espécies. Outro objectivo deste projecto foi desenvolver ensaios específicos que detectassem proteína Tau em liquido cefalorraquidiano de cão, um importante modelo longitudinal pré-clínico de farmacocinética, quedemonstra alterações no cérebro associadas com a idade e declínio cognitivo Com o conhecimento obtido através da caracterização dos anticorpos foi possível desenvolver ensaios que identificam Tau no liquido cefalorraquidiano de cão. A possibilidade de detectar regiões especificas da proteína Tau com grande sensibilidade poderá ser extremamente relevante na investigação e desenvolvimento de terapias para a doença de Alzheimer