Role of endophytic microbial community in pine wilt disease

Tese de doutoramento em Bioquímica, especialidade de Microbiologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraPine wilt disease (PWD), a major illness of several Pinus species, native to North-America, has spread into Asia and recently into Europe. The first report in Portugal was in 1999 but since 2008 has spread to the Center-North of the country. Bursaphelenchus xylophilus, the pinewood nematode (PWN), is considered the only causative agent of PWD. In recent years, it has been proposed that PWD is a complex disease induced by both PWN and the bacteria it carries. The present thesis aimed to assess the microbial community, within the host-plant and associated with the nematode upon nematode infection in PWD, in order to elucidate the community structure and to understand roles of several bacteria involved. The endophytic microbial community structure was studied from infected and non-infected pine trees, Pinus pinaster, in Avô and Malhada areas, based on culture isolates and molecular profiling (denaturing gradient gel electrophoresis - DGGE). The endophytic strains were identified by 16S rRNA gene sequencing. The classes Acidobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Betaproteobacteria, Flavobacteria, Gammaproteobacteria and Sphingobacteriia were identified from the sampling areas. Gammaproteobacteria were the most abundant bacteria. DGGE profiles failed to produce a common pattern for PWD indicating that the microbial community was diverse and variable within diseased pine trees. DGGE detected the presence of endophytes belonging to six additional classes: Bacteroidia, Deinococci, Fusobacteria, Spirochaetes, Planctomycetaceae and Verrumicrobiae. Furthermore, Archaea were found as part of the endophytic community (DGGE), belonging to the phyla Euryarchaeota, Thaumarchaeota and Crenarchaeota. Finally, the presence of nifH, nifJ, nirS and nirK genes in the endophytic bacterial community supports the possibility of N2 fixation inside the trees, and also denitrification, with the production of the metabolic relevant intermediary NO. The presence of Bacteria and Archaea as part of the endophytic community in P. pinaster could potentiate the ability of pine trees to adapt to changes in the habitat. An endophytic bacterium was characterized by a polyphasic approach and described as new species Chitinophaga costaii A37T2T. The diversity of PWN-associated bacteria in Portugal and USA was assessed in this work. The results obtained were compared with information from databases, in order to detect specific bacterial species associated with the nematode, and to make suggestions on the role of these bacteria in PWD. In Portugal, the associated bacteria were studied in the previously mentioned two sampling areas and in the first area where PWN was identified in this country, Setúbal. All isolates, except one Gram-positive strain (Actinobacteria), belonged to the Gram-negative Beta- and Gammaproteobacteria. Most isolates belonged to the genus Pseudomonas, Burkholderia or to the family Enterobacteriaceae. The strains were able, depending on sampled areas, to produce siderophores (60-100%), proteases activity (0-30%), and lipases activity (10-100%). This suggests that the ability to produce siderophores or lipases by most isolates may enable these bacteria to play a role in plant physiological response to external factors. In the USA, bacteria carried by PWN mainly belonged to the class Gammaproteobacteria. The genera Chryseobacterium (class Flavobacteriia) and Pigmentiphaga (class Betaproteobacteria) were for the first time found associated with nematodes in the USA. The major bacterial population associated with the nematodes differed depending on the forest area/country and none of the isolated bacterial species was found in all different forest areas. Only strains from the genus Pseudomonas were found carried by nematodes from all countries. Moreover, the potential nematotoxic activity of bacteria carried by PWN was tested. Twenty-one strains showed capacity to produce extracellular products with nematicidal activity. The strain with the highest nematicidal activity, Serratia sp. A88copa13, produced proteases in the supernatant and a serine protease with 70 kDa was identified as the major factor responsible for the toxicity against PWN and other Bursaphelenchus species. The genome of two bacterial strains, Serratia sp. M24T3 and Pseudomonas sp. M47T1, with nematotoxic activity was sequenced, in order to identify genes potential involved in toxicity towards PWN. The genome sequence of both strains featured genes that might be involved in nematotoxicity. In addition, potentially plant-growth promoting bacterial genes were also found in both genome sequences. The colonization process in Arabidopsis thaliana by Serratia sp. M24T3, labeled with gfp and gusA reporter genes, was evaluated and the identification genes potentially involved in plant growth promotion was investigated. Strain M24T3 showed potential to be a plant growth-promoting bacterium, since it produced siderophores, solubilized phosphate and zinc oxide and because it has a 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase gene, it most probably lowers plant ethylene levels. Findings with A. thaliana demonstrated Serratia sp. M24T3 to be able to colonize other plants beyond pine trees. In conclusion, the results presented in this thesis provided a broad overview and comprehensive insight of the microbial diversity and functionality related to PWD.A doença da murchidão do pinheiro (DMP), uma das principais doenças de várias espécies de Pinus, nativa da América do Norte, espalhou-se para a Ásia e, recentemente, na Europa. O primeiro registo em Portugal foi em 1999, mas em 2008 alastrou para o Centro-Norte do país. Bursaphelenchus xylophilus, o nemátode da madeira do pinheiro (NMP), é considerado o único agente causador da DMP. Nos últimos anos, tem sido proposto que a DMP é uma doença complexa induzida por ambos, o NMP e as bactérias a ele associadas. A presente tese teve como objectivo avaliar a comunidade microbiana, dentro da planta hospedeira e associada ao nematode, após infecção pelos nemátodes na DMP, a fim de elucidar a estrutura da comunidade e compreender a função das várias bactérias envolvidas. A estrutura da comunidade microbiana endofítica foi estudada a partir de pinheiros infectados e não infectados, Pinus pinaster, nas áreas de Avô e Malhada, com base no cultivo de isolados e no perfil molecular (electroforese em gel de gradiente desnaturante - DGGE). As estirpes endofíticas isoladas foram identificadas por sequenciação do gene 16S rRNA. Estirpes das classes Acidobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Betaproteobacteria, Flavobacteria, Gammaproteobacteria e Sphingobacteriia foram identificadas nas áreas de amostragem. Gammaproteobacteria foi a classe que apresentou maior número de isolados. Os perfis de DGGE da comunidade microbiana não apresentaram um padrão comum em pinheiros com DMP, indicando que a comunidade era diversa e variável dentro destes. DGGE detectou a presença de endófitos pertencentes a seis classes adicionais: Bacteroidia, Deinococci, Fusobacteria, Spirochaetes, Planctomycetaceae e Verrumicrobiae. Além disso, foram encontradas Archaea como parte da comunidade endofítica (DGGE), pertencente aos filos Euryarchaeota, Thaumarchaeota e Crenarchaeota. Finalmente, a presença dos genes nifH, nifJ, nirS e nirK na comunidade endofítica bacteriana suporta a possibilidade de fixação de N2 no interior das plantas, e também de desnitrificação, com a produção de NO intermediário metabólico relevante. A presença de Bacteria e Archaea como parte da comunidade endofítica em P. pinaster poderá potenciar a capacidade de adaptação dos pinheiros às mudanças no habitat. Uma das bactérias endofíticas foi caracterizada por uma abordagem polifásica e descrita como nova espécie Chitinophaga costaii A37T2T. A diversidade de bactérias associadas ao NMP em Portugal e nos EUA foi avaliada neste trabalho. Os resultados obtidos foram comparados com a informação contida nas bases de dados, a fim de detectar as espécies bacterianas associadas ao nemátode, e sugerir o papel destas na DMP. Em Portugal, foram estudadas as bactérias associadas das duas áreas de amostragem mencionadas anteriormente e na primeira área onde NMP foi identificado neste país, Setúbal. Todos os isolados, excepto uma estirpe Gram-positiva (Actinobacteria), pertenciam a Gram-negativos Beta- e Gammaproteobacteria. A maioria dos isolados pertencia aos géneros Pseudomonas, Burkholderia ou à família Enterobacteriaceae. As estirpes foram capazes, dependendo das áreas amostradas, de produzir sideróforos (60-100 %), ter actividade proteolítica (0-30 %) e actividade lipídica (10-100 %). Isto sugere que a capacidade de produzir sideróforos ou lípases, observada na maioria dos isolados, pode permitir que estas bactérias desempenhem um papel na resposta fisiológica da planta a factores externos. Nos EUA, as bactérias transportadas pelo NMP pertenciam principalmente à classe Gammaproteobacteria. Os géneros Chryseobacterium (classe Flavobacteriia) e Pigmentiphaga (classe Betaproteobacteria) foram pela primeira vez encontrados associados com nemátodes nos EUA. A população bacteriana maioritária associada aos nemátodes diferiram dependendo da área florestal/país e nenhuma das espécies bacterianas isoladas foi encontrada em todas as áreas florestais diferentes. Somente estirpes do género Pseudomonas foram encontradas como transportadas pelos nemátodes de todos os países. Além disso, foi testado o potencial da actividade nematotóxica das bactérias transportadas pelo NMP. Vinte e uma estirpes mostraram capacidade para produzir produtos extracelulares com actividade nematicida. A estirpe com maior actividade nematicida, Serratia sp. A88copa13, produziu protéases no sobrenadante e uma protéase serínica com 70 kDa foi identificada como o principal factor responsável pela toxicidade contra o NMP e outras espécies de Bursaphelenchus. Os genomas das duas estirpes bacterianas, Serratia sp. M24T3 e Pseudomonas sp. M47T1, com actividade nematotóxica foram sequenciados, a fim de identificar potenciais genes envolvidos na toxicidade para NMP. A sequência do genoma de cada uma das estirpes apresentou genes que podem estar envolvidos na nematotoxicidade. Além disso, potenciais genes bacterianos de promoção de crescimento de plantas foram encontrados em ambas as sequências do genoma. O processo de colonização em Arabidopsis thaliana pela Serratia sp. M24T3, marcada com os genes repórteres gfp e gusA, foi avaliado e a identificação de genes potencialmente envolvidos na promoção do crescimento das plantas que coloniza foi investigada. A estirpe M24T3 mostrou potencial para ser uma bactéria promotora do crescimento da planta, uma vez que produziu sideróforos, solubilizou fosfato e óxido de zinco e porque tem um gene de desaminase de 1-aminociclopropano-1-carboxilato, que muito provavelmente reduz os níveis de etileno das plantas. Os resultados obtidos com A. thaliana indicam que Serratia sp. M24T3 é capaz de colonizar outras plantas além pinheiros. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese proporcionaram uma visão ampla e abrangente da diversidade microbiana e funcionalidade relacionada à DMP