Molecular mechanisms involved in glucose and lipid metabolism after immunosuppressive therapy

Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraDiabetes mellitus is a widespread and growing public health problem due mainly to the aging of the population and changes in diet and life style. The clinical diagnosis of diabetes has increased worldwide, including in Portugal. About one third of the population is pre-diabetic and/or undiagnosed diabetic. Diabetes is associated with the metabolic syndrome, which is characterized by several risk factors, including insulin resistance and dyslipidemia. These are two of the main metabolic complications that may also appear after transplantation. Organ transplant is a therapeutic measure of last resort for patients with end-stage diseases who have exhausted all other available treatments without improvement. The most important issue in organ transplantation is to ensure the graft versus host survival; in the last decades, advances in immunosuppressive therapy have led to an important improvement. Calcineurin inhibitors, such as cyclosporine A (CsA), are cornerstones of immunosuppressive therapy; however recently other agents, like sirolimus (SRL), a mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor, have been developed in order to produce protocols that able to minimize the use of calcineurin inhibitors. Although very effective in their functions as immunossupressors, both agents are associated with new onset diabetes after transplantation (NODAT) and dyslipidemia. Development of these metabolic complications increases the risk for graft failure and patient death. However, the molecular mechanisms underlying these metabolic effects are not fully elucidated and animal’s studies are important to clarify these aspects. In this thesis we aimed to understand the effects of therapeutic doses of CsA (5 mg/kg/day) and SRL (1 mg/Kg/day) in glucose and lipid metabolism in peripheral insulin sensitive tissues, such as adipose tissue, muscle and liver in an in vivo rat model, after short and long treatments. The CsA-treated group presented an impaired response to glucose during a glucose tolerance test, particularly at the 15 min time point. The glucose excursion curve for SRL was also impaired, as the recovery kinetics of blood glucose levels were slower, compared to the vehicle group. Furthermore, during an ITT, the decrease in blood glucose levels in the CsA-treated group was delayed 60 min, compared to the vehicle group. Interestingly, after 9 weeks, SRL-treated animals were hyperinsulinemic while CsA-treated animals presented lower insulin values, suggesting glucose intolerance and insulin resistance in both treated groups. Moreover, a significant reduction in the insulin-stimulated glucose uptake over basal was observed in isolated adipocytes, whether treated ex vivo or in vivo with CsA and SRL. Phosphorylation of the main proteins in the insulin cascade, namely IR (insulin receptor) at Tyr1146, IRS-1 (insulin receptor substrate-1) at Tyr612, Akt/PKB (protein kinase B) at both Ser473 and Thr308 was suppressed in the SRL group, which could explain the observed reduction in glucose uptake. In fact, impaired Akt/PKB activation leads to a decrease in phosphorylation of the substrate, AS160, which might block the insulin-stimulated translocation of glucose transporters to the cell membrane and therefore, the glucose uptake. Although none of the proteins involved in the insulin cascade were significantly affected by the CsA treatment, effects on key enzymes for hepatic gluconeogenesis suggest that CsA stimulates this mechanism. In fact, CsA increased protein levels of two of the enzymes involved in gluconeogenesis, glucose-6-phosphatase (G6Pase) and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) in the liver as well as the transcription factors peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC1-α) and forkhead box protein O1 (FOXO1), which may contribute to enhanced gluconeogenesis. We also observed a significant increase in protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), a negative regulator of insulin, in the CsA-treated group in the liver, indicating increased insulin resistance. CsA-treated animals presented an increase in serum non-esterified fatty acid (NEFA) and triglycerides (TGs) after 9 weeks of treatment. Moreover, CsA and SRL treatments of rats for 3 and 9 weeks increased isoproterenol-stimulated lipolysis in isolated adipocytes by 5-9 fold and 4-6 fold, respectively. The increase in lipolysis might have been due to the observed increase in the expression of the main lipolytic protein, hormone-sensitive lipase (HSL). SRL treatment also caused ectopic deposition of TGs in liver and muscle after 3 weeks. Additionally, SRL treatment reduced the expression of lipogenic genes, including acetyl-CoA carboxylase 1 (ACC1), lipin 1, peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) and stearoyl-CoA desaturase (SCD1) in adipose tissue. The reduced expression of lipogenic factors in adipose tissue might have impaired lipid storage on this tissue, and contributed to the observed ectopic deposition of fat in liver and muscle. Furthermore, we used a higher dose of CsA (15mg/kg/day) in vivo for 15 days, in order to evaluate CsA effects in glucose and lipid metabolism. This was done through quantification of 2H-enrichment of glucose, glycogen and TG after 2H2O administration by 2H NMR. Although we determine that CsA at this dose affects body weight and glucose tolerance, we could not see differences in glycogen synthesis or de novo lipogenesis, under these conditions. In conclusion, the molecular and metabolic changes observed in this work contributes to a better understanding of the mechanisms involved in the development of NODAT and dyslipidemia after immunosuppressive therapy, thus opening new possibilities for prevent these serious side-effects and improve grafts and patients survival.Diabetes mellitus é uma doença que tem vindo a aumentar em todo o Mundo, devido ao envelhecimento da população e à alteração do estilo de vida, tendo-se tornado num problema de saúde pública. Um terço da população encontra-se num estado de pré-diabetes ou diabetes não diagnosticada. A diabetes está associada à síndrome metabólica, que é caracterizada por diversos fatores de risco, nomeadamente resistência à insulina e dislipidemia. Estas duas complicações metabólicas podem ocorrer após um transplante de órgãos, que é o último recurso terapêutico para pacientes com doença em estádio terminal. A questão mais importante é garantir a prevenção da rejeição do transplante pelo hospedeiro; recentes avanços na terapia imunossupressora têm vindo a aumentar a taxa de sucesso. Os inibidores de calcineurina, como a ciclosporina A (CsA), são um marco terapêutico, no entanto, nos últimos anos outros fármacos como o Sirolimus (SRL), um inibidor do alvo da rapamicina nos mamíferos (mTOR), foram desenvolvidos. De facto, apesar de muito eficazes, estes dois fármacos estão associados a efeitos secundários, incluindo diabetes pós-transplante e dislipidemia, que aumentam o risco de rejeição do transplante e morte de paciente. Como os mecanismos moleculares subjacentes a estes efeitos metabólicos não estão totalmente elucidados, é da maior importância utilizar modelos animais para os estudar in vivo. O principal objetivo deste estudo foi avaliar, em ratos Wistar, os efeitos de doses terapêuticas de CsA (5 mg/kg peso/dia) e SRL (1 mg/Kg peso/dia) administradas de forma aguda (3 semanas) e crónica (9 semanas) no metabolismo da glucose e de lípidos, nos tecidos periféricos sensíveis à insulina – fígado, músculo e tecido adiposo. Os animais tratados com CsA apresentaram uma resposta insuficiente no teste de tolerância à glucose, uma vez que a concentração de glucose era mais elevada 15 minutos depois de a glucose ser administrada comparativamente ao grupo veículo. Nos animais tratados com SRL, verificou-se também alteração da curva de concentração de glucose, pois a cinética de recuperação da concentração de glucose no sangue foi mais lenta. Durante o teste de tolerância à insulina em animais tratados com CsA, a concentração de glucose diminuiu ao fim de 60 minutos, requerendo mais tempo que os animais do grupo veículo. Após 9 semanas de tratamento os animais tratados com SRL estavam hiperinsulinémicos, enquanto os animais tratados com CsA apresentavam concentrações mais baixas de insulina, comparativamente aos animais do grupo veículo, sugerindo intolerância à glucose e resistência à insulina em ambos os grupos. Verificou-se uma redução significativa na captação da glucose por adipócitos isolados estimulados por insulina, em comparação com o nível basal, quer para os adipócitos tratados ex vivo com CsA e SRL, quer para aqueles provenientes dos estudos in vivo. Também, se observou, nos animais tratados com SRL, a inibição da fosforilação das principais proteínas da via de sinalização de insulina, nomeadamente no resíduo Tyr1146 do recetor de insulina (IR), no resíduo Tyr612 do substrato do recetor de insulina (IRS-1) e dos resíduos Ser473 e Thr308 da proteína quinase B (Akt), o que pode explicar a redução observada na captação da glucose. De facto, a diminuição da ativação da Akt conduz à diminuição na fosforilação do substrato AS160, o que pode levar ao bloqueio da translocação dos transportadores de glucose para a membrana plasmática das células e consequentemente a captação da glucose. Em contraste, o tratamento com CsA não afetou a fosforilação de nenhuma das proteínas desta via de sinalização. No entanto, o tratamento com CsA induziu a gliconeogénese dado o aumento da expressão proteica de duas enzimas envolvidas neste processo – G6Pase e PEPCK, assim como dos fatores de transcrição PGC1-α e FOXO1. Também se observou, no fígado dos animais tratados com CsA, um aumento do PTP1B, regulador negativo da insulina, indicando resistência de insulina. Os animais tratados com CsA apresentaram, após 9 semanas de tratamento, um aumento da concentração de NEFA e TGs em circulação. Verificou-se também o aumento significativo da lipólise em adipócitos isolados, estimulados com isoproterenol, em ambas as durações do tratamento e com ambos os fármacos, quando comparada com a lipólise em adipócitos do grupo veículo. A indução da lipólise pode dever-se ao aumento observado na expressão de uma das mais importantes proteínas lipolíticas, a HSL. Estes resultados sugerem que o aumento da lipolise in vivo com CsA e o SRL pode contribuir para a dislipidemia observada durante a terapia imunossupressora. O tratamento com SRL durante 3 semanas causou deposição ectópica de TG no músculo e fígado e reduziu a expressão de genes lipogénicos no tecido adiposo, nomeadamente ACC1, lipin-1, PPAR-γ e SCD1. Esta redução pode levar a uma diminuição no armazenamento da gordura no tecido adiposo e contribuir para a deposição de gordura observada no fígado e músculo. Para avaliar os efeitos no metabolismo da glucose e lípidos através da identificação de metabolitos por 2H NMR foi administrada uma dose mais elevada de CsA (15mg/kg peso/dia) durante 2 semanas. Foi feita a determinação da glucose, do glicogénio e dos TG, que incorporaram 2H proveniente de água deuterada (2H2O). Embora tenha sido observado que nesta dose a CsA diminui o peso dos animais e a tolerância à glucose, não foram detetadas diferenças significativas na síntese de glicogénio nem na lipogénese de novo. Em conclusão, as alterações metabólicas encontradas neste trabalho podem ajudar a revelar a origem do desenvolvimento da diabetes pós-transplante e dislipidemia depois da terapia imunossupressora, abrindo assim novas possibilidades de prevenção destes efeitos secundários, como forma de melhorar a sobrevivência dos enxertos e dos doentes transplantados.FCT - SFHR/BD/61405/200