Regulação genética do receptor 5-HT2A na Demência Frontotemporal

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraA demência foi definida como um dos principais desafios do século XXI, devido à sobrecarga que é imposta, não apenas aos cuidadores, mas também aos sistemas social e de saúde. Assim, as demências devem ser o foco, não apenas para o planeamento de cuidados específicos a todos os níveis, na sociedade, mas também para a investigação mais aprofundada e eficaz. A Degenerescência Lobar Frontotemporal (DLFT), a segunda causa mais frequente de demência neurodegenerativa precoce, inclui um grupo de doenças heterogéneas que têm em comum a degenerescência seletiva dos lobos frontais e/ou temporais, mas com subtipos clínicos e neuropatológicos distintos. A idade de início varia entre os 45-65 anos e a duração entre 6-8 anos. Existe uma distribuição semelhante entre os géneros. Atualmente, a DLFT inclui essencialmente três síndromes clínicas: a variante de comportamento da Demência Frontotemporal (vcDFT) e duas variantes da linguagem - a Demência Semântica (DS) e a Afasia Progressiva Não Fluente (APNF). Além disso, existem variantes menos frequentes ou indefinidas, que correspondem a uma sobreposição de sintomas com outras doenças motoras, nomeadamente quando se associa a Doença do Neurónio Motor ou a sinais parkinsónicos: a DFTP-17 (associada a mutações no cromossoma 17), a Degenerescência Corticobasal e a Paralisia Supra-Nuclear Progressiva. A heterogeneidade genética da DLFT evidencia-se pela identificação de mutações nos genes MAPT, GRN VCP, CHMP2B, TARDBP. FUS e C9ORF72. No entanto, desconhecem-se ainda as causas genéticas envolvidas em aproximadamente 30% dos doentes que manifestam uma história familiar positiva, bem como o mecanismo subjacente à etiologia da DLFT. Apesar dos poucos estudos existentes, tem sido evidenciada uma disfunção do sistema serotoninérgico, que desempenha um papel importante na modulação comportamental, associada à DLFT. Foi descrita a diminuição significativa do recetor serotoninérgico 5-HT2A, envolvido em funções cognitivas, tais como a memória e a aprendizagem, em áreas cerebrais de doentes com DLFT. Adicionalmente, foi descrita uma associação genética entre os polimorfismos do 5HTR2A (gene codificante do 5-HT2A) e os sintomas psicóticos na Demência de Alzheimer, que possui algumas características clínicas e neuropatológicas comuns à DLFT. Por conseguinte, o gene 5HTR2A constitui um bom candidato para ser estudado como fator de suscetibilidade para o desenvolvimento desta patologia Nesse sentido, o objetivo neste trabalho foi averiguar o envolvimento do gene 5HTR2A na patogénese da DLFT. O gene 5HTR2A foi analisado para a identificação de variações de sequência que pudessem eventualmente estar associadas ao fenótipo clínico de DLFT. Foram incluídos 70 doentes com o diagnóstico provável de DLFT, avaliados na Consulta de Demências no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, E.P.E.. O DNA foi extraído a partir de sangue e a análise genética foi realizada através de amplificação por PCR, usando primers específicos, e subsequente sequenciação automática. Na análise estatística, incluindo a correlação genótipo-fenótipo, foram usados os testes de 2 e exato de Fisher (nível de significância quando p<0,05). Foram identificadas 17 variações de sequência (13 descritas e 4 novas), confirmadas posteriormente por PCR-RFLP. Não foi encontrada associação de qualquer das variantes com a DLFT. Os resultados sugerem que as variações de sequência identificadas no gene 5HTR2A não constituem uma causa primária para o desenvolvimento da DLFT ou um fator de risco para algum subgrupo clínico. Contudo, não pode ser excluído o seu envolvimento sem estudos funcionais adicionais. Adicionalmente, as variações de sequência identificadas, que têm como consequência a alteração de aminoácido ou que se localizam em regiões reguladoras, foram analisadas para verificar a sua ocorrência num grupo constituído por 92 indivíduos saudáveis (ajustados para etnicidade, idade e género, sem problemas neurológicos), tendo sido realizado um estudo de associação caso-controlo. As variações de sequência selecionadas foram genotipadas por mini-sequenciação, sequenciação de Sanger e PCR-RFLP. O estudo de associação caso-controlo sugere que o alelo G do rs3125 (localizado na região reguladora 3’UTR) pode constituir um fator de risco associado ao desenvolvimento de vcDFT em mulheres (genótipos: p=0.047, alelos: p=0.037). Foi igualmente obtido um valor estatisticamente borderline, na comparação genotípica entre os doentes com DLFT de início precoce e os indivíduos saudáveis com menos de 65 anos (genótipos: p=0.052, alelos: p=0.066). Finalmente, a patogenicidade da alteração genética rs3125 foi avaliada através de um estudo funcional. O RNA foi extraído a partir de plaquetas e células mononucleares do sangue periférico de 6 mulheres doentes com o diagnóstico provável de vcDFT e 10 mulheres saudáveis. A genotipagem do rs3125 foi realizada para ambas as isoformas do 5HTR2A por sequenciação de Sanger e PCR-RFLP. Os níveis de RNAm de cada transcrito foram quantificados por PCR em tempo real quantitativo relativo, após a seleção do controlo endógeno mais apropriado. Foi observada uma diminuição estatisticamente significativa da expressão do transcrito NM_000621.4 nas mulheres doentes (vcDFT) portadoras do genótipo GG, comparativamente às saudáveis. Este resultado poderá constituir uma possível justificação para a associação obtida do alelo G como um fator de risco para a vcDFT (no estudo de associação caso-controlo). Tendo em conta a literatura científica disponível, este estudo forneceu a primeira evidência de que o gene 5HTR2A poderá estar envolvido na suscetibilidade para a vcDFT, sendo por isso, uma contribuição relevante para o esclarecimento da patogenicidade da DLFT.Dementia has already been established as one of the major challenges of the XXIst century, due to the tremendous burden imposed, not only to caregivers, but also on social and health systems. Thus, dementia type disorders should be the focus for, not only specific care planning at all levels in the society, but also for extensive cost-effectiveness research. Frontotemporal lobar degeneration (FTLD), the second most common cause of early-onset neurodegenerative dementia, encompasses a heterogeneous group of diseases that share selective degeneration of frontal and/or temporal lobes, but with different clinical and neuropathological subtypes. The age of onset ranges between 45-65 years and the duration of illness is 6-8 years. There seems to be an equal distribution between genders. Currently, FTLD includes essentially three clinical syndromes: the behavioral variant of FTD (bvFTD) and two language variants - Semantic Dementia (SD) and Progressive Non-fluent Aphasia (PNFA). Additionally, there are less frequent or undefined variants that correspond to an overlap of symptoms with other motor disorders, namely when associated with Motor Neuron Disease or parkinsonian signs: DFTP-17 (associated with mutations in chromosome 17), Corticobasal Degeneration and Progressive Supranuclear Palsy. Genetic heterogeneity of FTLD is reflected by the identification of mutations in MAPT, GRN, VCP, CHMP2B, TARDP, FUS and C9ORF72 genes. However, the genetic causes involved in approximately 30% of patients with positive family history and the exact mechanism underlying the aetiology of FTLD are still unknown. Despite the limited number of studies, an association between serotoninergic system dysfunction, which plays an important role in human behavior modulation, and FTLD has become evident. A significant loss of 5-HT2A serotoninergic receptor, involved in cognitive functions such as learning and memory, was reported in the brain areas of FTLD patients. Furthermore, genetic association between 5HTR2A (5-HT2A encoding gene) polymorphisms and psychotic symptoms was described in Alzheimer’s disease, which shares an overlap of neuropathological and clinical aspects with FTLD. Therefore, 5HTR2A gene is a good candidate to be studied as a susceptibility factor for the development of this pathology. Accordingly, the aim of this work was to analyze the involvement of 5HTR2A gene in FTLD pathogenesis. 5HTR2A gene was analyzed in order to identify sequence variations that could be associated with FTLD clinical phenotype. We have studied 70 patients with probable diagnosis of FTLD, followed in dementia consultation of “Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra E.P.E.”. DNA was extracted from blood and genetic analysis of 5HTR2A was performed by PCR amplification, using specific primers, followed by automated sequencing. Statistical analysis, including for genotype-phenotype correlation, was performed using 2 and Fisher’s exact tests (significance considered when p