Regulació posttraduccional de l’alanina aminotransferasa mitjançant mecanismes d’interacció proteïna-proteïna

[cat] Una de les principals fites en aqüicultura és aconseguir una reducció de les proteïnes que se subministren amb la dieta, procedents majoritàriament de farines de peix, i incrementar la presència de nutrients més rendibles, com ara els carbohidrats. En tractar-se principalment d'espècies carnívores, la substitució de proteïnes per carbohidrats està limitada per les característiques metabòliques dels peixos en cultiu. L'activitat alanina aminotransferasa (ALT) hepàtica juga un paper central com a connexió entre el metabolisme d'aminoàcids i el de carbohidrats, i s'ha mostrat com l'aminotransferasa hepàtica més sensible a canvis en l'estat nutricional i la utilització de proteïna en moltes espècies de peixos. L'ALT pot estar implicada en múltiples processos cel.lulars i la seva activitat podria estar sotmesa a un sistema complex de regulació. El nostre grup va clonar tres isoenzims d'ALT a partir de fetge de Sparus aurata, indicant l'existència de dues isoformes citosòliques, cALT1 i cALT2, i una isoforma mitocondrial mALT, de diferent distribució tissular i regulació nutricional. Donat que les modificacions posttraduccionals a què pot estar sotmesa l'ALT són poc conegudes, es va voler estudiar si existeixen proteïnes capaces d'interaccionar i modular l'activitat de les isoformes citosòliques d'ALT. Mitjançant un assaig de doble híbrid en llevat s'ha identificat els fragments de quatre proteïnes amb potencialitat d'interacció amb cALT2, que corresponen a l'F-lectina, RPS20, RBP2 i HABP2. F-lectina és una proteïna d'unió a carbohidrats present en peixos i amfibis, que presenta un pèptid senyal de secreció. Estudis de localització subcel•lular indiquen que, tot i que cALT1 i cALT2 són preferentment citosòliques, quan s'expressen conjuntament amb l'F-lectina, les proteïnes passen a formar vesícules perinuclears de gran mida que colocalitzen amb marcadors de cis-Golgi, trans-Golgi i vesícules de secreció. Aquest fet suggereix que les proteïnes cALT1 i cALT2 són incorporades a la via de secreció a través de la interacció amb F-lectina. Els anàlisis de FRET validen la interacció entre cALT1 o cALT2 i F-lectina. En cèl.lules transfectades amb plasmidis d'expressió de cALT1, cALT2 i F-lectina, la presència d'F-lectina augmenta l'activitat ALT en els extractes on s'expressa cALT1 o cALT2, suggerint que l'F-lectina és capaç de modular l'activitat d'ALT. F-lectina s'expressa majoritàriament en fetge, ronyó i teixit adipo& teixits on també s'expressen cALT1 i cALT2. En orades injectades intraperitonealment amb lipopolisacàrid (LPS) 1mg/kg de peix, 24 hores després del tractaments'observa un increment en l'expressió d'F-lectina, i un augment en l'activitat ALT en extractes hepàtics, sense observar canvis en els nivells d'mRNA de cap de les isoformes ALT. L'augment de l'activitat ALT és degut, hipotèticament, a un augment en l'expressió d'F-lectina, que a la seva vegada provoca un augment en l'activitat de l'enzim ALT a través de la interacció de l'F-lectina amb cALT1 i cALT2. Addicionalment, s'ha observat que la incubació de cultius bacterians E. coli amb extractes cel.lulars on se sobreexpressen les proteïnes cALT2, F-lectina i cALT2 conjuntament amb F-lectina, produeix una inhibició del creixement bacterià. Aquesta efecte antibacterià es podria donar pel fet que cALT2 conté una regió homòloga a la regió d'unió a endotoxines de la proteïna LBP, responsable de la unió i presentació de I'LPS a altres proteïnes del sistema immunitari. Els nostres estudis suggereixen que a més del seu paper metabòlic, les isoformes citosòliques d’ALT poden estar implicades en processos del sistema immunitari en orada.[eng] One of the main goals in aquaculture is to reduce proteins and to increase the presence of more sustainable nutrients in diets. The substitution of proteins for carbohydrates is limited by the metabolic characteristics of carnivorous fish. The activity of alanine aminotransferase (ALT) in liver plays a central role as a link between amino acids and carbohydrate metabolism, and is sensitive to changes in nutritional status and utilization of protein in many species of fish. Our group cloned three isoenzymes of ALT in the liver of Sparus aurata (two cytosolic isoforms and a mitochondrial one), with different tissue distribution and nutritional regulation. ALT post-translational modifications are unknown, and we studied the existence of proteins which may interact and modulate ALT activity. We identified four fragments of proteins with potential interaction with cALT2, corresponding to F-lectin, RPS20, RBP2 and HABP2. Although cALT1 and cALT2 are preferably cytosolic, when coexpressed with F-lectin, a secretion protein, the proteins became part of large perinuclear vesicles that colocalize with cis-Golgi, trans-Golgi and secretion vesicles markers. This suggests that cALT1 and cALT2 are included in the secretory pathway through the interaction with F-lectin. The interaction between cALT1 or cALT2 and F-lectin was validated with an alternative method. The expression of F-lectin increased ALT activity in cells expressing cALT1 or cALT2, suggesting that F-lectin is able to modulate the activity of ALT. F-lectin is expressed mainly in liver, kidney and adipose tissue, tissues where cALT1 or cALT2 are also expressed. In fish treated intraperitoneally with lipopolysaccharide (LPS) we observed an increase in F-lectin expression, and an increase of ALT activity in liver extracts, without changes in mRNA levels of any ALT isoform. Hypothetically, the increased ALT activity is due to an increase in the expression of F-lectin, which in turn causes an increase in the activity of ALT enzymes. The incubation of bacterial E. coli cultures with cell extracts in which cALT2, F-lectin and cALT2 together with F-lectin are overexpressed, produces an inhibition of bacterial growth. This antibacterial effect could occur because cALT2 seems to contain a region homologous to endotoxin binding region in LBP protein. Our studies suggest that, in addition to their metabolic role, ALT cytosolic isoforms may be involved in immune processes in sea bream