Estudios funcionales y estructurales en quinasas dependientes de ADP relacionadas con el metabolismo de glucosa en Archaea

[spa] En algunos organismos Archaeas, la vía glicolítica presenta modificaciones entre las que destaca las enzimas quinasas que fosforilan glucosa y fructosa 6-fosfato utilizando ADP en vez de ATP como dador de grupo fosforilo. Estas enzimas pertenecen a la superfamilia riboquinasa, puntualmente a la familia de quinasas dependientes de ADP, y están conformadas por un dominio menor y un dominio mayor el cual presenta un plegamiento tipo riboquinasa, común a todos los miembros esta superfamilia. La mayoría de estas quinasas han sido descritas en arqueas hipertermófilas como Thermococcus litoral (TlGK), metanogénicas bifuncionales, con actividad glucoquinasa (GK) y fosfofructoquinasa (PFK), de Methanococcus jannaschii o Methanococcus maripaludis, aunque también se han encontrado en organismo eucariontes como humano y ratones. En esta tesis se estudió la enzima glucoquinasa de TlGK como modelo de una quinasa hipertermófila dependiente de ADP pata conocer los determinantes estructurales en el mecanismo cinético y la especificidad por ADP o ATP mediante cristalografía de rayos –X y estudios cinética enzimática. Los resultados confirmaron que la TlGK experimenta cambios en su conformación como consecuencia de la unión de sus ligandos demostrado en las estructuras de la proteína, donde se distinguió que la proteína en su forma apo (2.0 Å) presenta una mayor distancia entre sus dominios (conformación abierta), mientras que en la estructura en complejo ternario (2.5 Å) esta distancia se reduce mostrando una estructura cerrada. Estos resultados se relacionan con el mecanismo cinético ordenado en secuencia, donde la unión de MgADP, induce el primer cambio conformacional en la enzima, seguido por la unión de glucosa provocando el cierre de los dominios de la enzima. Dichos cambios conformacionales son estabilizados por una serie de interacciones que se coordinan entre los dominios menor y mayor. La especificidad por el nucleótido fue evaluada generando una versión permutante de la TlGK (perGK), que imita la topología de la región β-meandro de las quinasas dependientes de ATP, que constituye casi por completo el sitio de unión del nucleótido. Los resultados indican que la enzima perGK utiliza ADP, en vez de a ATP como dador de grupo fosforilo, revelando que la permutación no es suficiente para el cambio en la especificidad del nucleótido. Estudios cinéticos señalan que el mecanismo de perGK es ordenado en secuencia, no obstante, el orden de unión de los sustratos varió, respecto a lo observado para la enzima TlGK. Estos cambios fueron apoyados con las estructuras cristalinas de la proteína perGK en su forma apo (2.14 Å), en complejo con glucosa (1.95 Å) y el complejo ternario (2.44 Å), generadas por cristalografía de rayos-X, donde se infiere que la enzima perGK sufre un cambio en su conformación luego que se une glucosa, no así con la unión de MgADP, en claro contraste con TlGK. Por tanto, este cambio en la topología, posiblemente, haya sido uno de los cambios estructurales que experimentaron estas enzimas, de la superfamilia de riboquinasas, a lo largo de su historia evolutiva para transformarse a quinasas dependientes de ADP. La enzima dependiente de ADP, MjPfk/GK, que posee las dos actividades PFK y GK en la misma cadena polipeptidica, es la única enzima caracterizada de este tipo del orden de las Methanococcales, por lo que se desconoce si este carácter bifuncional de la enzima es un rasgo particular de MjPfk/GK, o si es una característica común de los miembros de este orden. En este estudio se determinó que el mecanismo cinético de la enzima MjPfk/GK es secuencial para ambas reacciones, y solo tiene la capacidad de fosforilar glucosa y fructosa-6-fosfato, siendo muy específica de la vía glicolítica. Además, se confirmó que la enzima fosfofructoquinasa del mesófilo M. maripaludis presenta actividad GK además de actividad PFK sugiriendo que este carácter bifuncional sea un rasgo compartido por otras enzimas homologas del orden Methanococcales. Finalmente, se dilucidó que la actividad GK en ambas enzimas bifuncionales se ve afectada por las concentración libre de Mg2+ y AMP, lo que nos lleva a pensar que estos metabolitos pueden ser claves para promover la vía glicolítica actuando como un sensor de la disponibilidad de energía celular aportada por ADP o ATP.[eng] In some Archaea, the glucose degradation proceeds through a modified version of glycolytic pathway where phosphorylation of glucose and fructose 6-phosphate is performed by kinases that use ADP instead ADP as phosphoryl donor. These enzymes belong to ribokinase superfamily due to share ribokinase folding type. Also these enzymes are found in Archaea from Thermococcales and Methanococcales orders. In these studies we reported that the glucokinase of T.litoralis (TlGK) undergoes changes in its conformation due to the binding of its ligands shown in the structures of the protein in the absence and presence of their ligands. These structural changes are relate to sequentially ordered kinetic mechanism, where MgADP binding induces the firth conformational change, followed by binding of glucose, causing the approach of the domains of the enzyme. These conformational changes are stabilized by a series of interactions that are coordinated between the smallest and largest domains. Also, it was revealed that the permutation in the β- meander regions of TlGK, which is almost entirely the nucleotide binding site, is not sufficient to change the specificity of the nucleotide. The kinetic studies indicated that the kinetic mechanism perGK is ordered in sequence, however, the order of binding of the substrates varied with respect to that observed for the enzyme TlGK. These changes were supported by the crystal structures of the perGK protein in their apo form, with glucose and the ternary complex, generated by crystallography X-rays. Therefore, this change in topology possibly has been one of the structural changes experienced by these enzymes, riboquinasas superfamily, along their evolutionary history to transform ADP-dependent kinases. On the other hand, we study on the ADP-dependent MjPfk/GK kinase, which owns both phosphofructokinase and glucokinase activity in the same polypeptide chain, it was determined that the enzyme has a sequential mechanism for both reactions and that this enzyme is specific for glucose and fructose 6P, being highly specific in the glycolytic pathway. Furthermore, it was confirmed that the enzyme phosphofructokinase mesophyll M. maripaludis GK also has activity PFK activity suggesting that this bifunctional character is shared by other homologous enzymes enforcement Methanococcales order. Finally, it was elucidated that the GK activity in both bifunctional enzyme is affected by the free concentration of Mg2 + and AMP, which leads us to believe that these metabolites may be key to promoting glycolytic pathway acting as a sensor of energy availability cell provided by ADP or ATP