Impacto de canabinóides na gravidez: efeitos em células trofoblásticas

Mestrado em Biologia Molecular e CelularCannabinoids (CBs) can be classified as: phytocannabinoids, the constituents of the Cannabis sativa plant; synthetic cannabinoids lab-synthesized and the endocannabinoids that are endogenous lipid mediators. Cannabinoid compounds activate cannabinoid receptors – CB1 and CB2. The most prevalent psychoactive phytocannabinoid is Δ9tetrahydrocannabinol (THC), but more than 60 different CBs were already identified in the plant. The best characterized endocannabinoids (eCBs) are anandamide (AEA) and 2arachidonoylglycerol (2-AG), that are involved in several physiological processes including synaptic plasticity, pain modulation, energy homeostasis and reproduction. On the other hand, some synthetic cannabinoids that were initially designed for medical research, are now used as drugs of abuse. During the period of placental development, highly dynamic processes of remodeling occur, involving proliferation, apoptosis, differentiation and invasion of trophoblasts. It is known that a tight control of eCBs levels is required for normal pregnancy progression and that eCBs are involved in trophoblast cells turnover. Therefore, by sharing activation of the same receptors, exposure to exocannabinoids either by recreational or medicinal use may lead to alterations in the eCBs levels and in the endocannabinoid system homeostasis In this work, it was studied the impact of CBs in BeWo trophoblastic cells and in primary cultures of human cytotrophoblasts. Cells were treated for 24 hours with different concentrations of THC, the synthetic cannabinoid WIN‐55,212 (WIN) and 2-AG. Treatment with THC did not affect BeWo cells viability while WIN and 2-AG caused a dose-dependent viability loss. Morphological studies together with biochemical markers indicate that 2-AG is able to induce apoptosis in cytotrophoblasts. On the other hand, morphological studies after acridine orange staining suggest that autophagy may take part in WIN-induced loss of cell viability. All cannabinoids caused a decrease in mitochondrial membrane potential (Δψm) but only 2-AG led to ROS/RNS generation, though no changes in glutathione levels were observed. In addition, ER-stress may be involved in the 2-AG induced-oxidative stress, as preliminary results point to an increase in CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) expression. Besides the decrease in cell viability, alterations in cell cycle progression were observed. WIN treatment induced a cell cycle arrest in G0/G1 phase, whereas 2-AG induced a cell cycle arrest in G2/M phase. Here it is reinforced the relevance of cannabinoid signaling in fundamental processes of cell proliferation and cell death in trophoblast cells. Since cannabis-based drugs are the most consumed illicit drugs worldwide and some of the most consumed recreational drugs by pregnant women, this study may contribute to the understanding of the impact of such substances in human reproduction.Os canabinóides (CBs) podem ser classificados como: fitocanabinóides, os constituintes da planta Cannabis sativa L.; canabinóides sintéticos, sintetizados em laboratório e os endocanabinóides, que são mediadores lipídicos endógenos. Os compostos canabinóides ativam recetores canabinóides – CB1 e CB2. O composto psicoativo mais prevalente é o Δ9-tetrahidrocanabinol (THC), mas mais de 60 diferentes CBs foram já identificados a partir da planta. Os endocanabinóides (eCBs) melhor caracterizados são a anandamida (AEA) e o 2-araquidonoilglicerol (2-AG), que estão envolvidos em vários processos biológicos, incluindo plasticidade sináptica, modulação da dor, homeostasia energética e reprodução. Por outro lado, alguns canabinóides sintéticos, inicialmente projetados para investigação médica, são agora usados como drogas de abuso. Durante o período de desenvolvimento placentário ocorrem processos de remodelação que envolvem proliferação, apoptose, diferenciação e invasão dos trofoblastos. Sabe-se que um controlo rigoroso dos níveis de eCBs é necessário para uma progressão normal da gravidez e que os eCBs estão envolvidos no turnover celular dos trofoblastos. Assim sendo, ao partilharem a ativação dos mesmos recetores, a exposição a exocanabinóides, seja pelo uso recreativo ou medicinal, pode levar a alterações nos níveis de eCBs e na homeostasia do sistema endocanabinóide (ECS). Neste trabalho foi estudado o impacto dos CBs em células trofoblásticas BeWo e em culturas primárias de citotrofoblastos humanos. As células foram tratadas durante 24 horas com diferentes concentrações de THC, do canabinóide sintético WIN-55,212 (WIN) e de 2AG. O tratamento com THC não afetou a viabilidade das células BeWo, enquanto que o WIN e o 2-AG causaram uma perda de viabilidade dependente da dose. Estudos morfológicos, juntamente com marcadores bioquímicos, indicam que o 2-AG é capaz de induzir apoptose em citotrofoblastos. Por outro lado, estudos morfológicos realizados com laranja de acridina sugerem que a autofagia pode estar envolvida na perda de viabilidade induzida pelo WIN. Todos os canabinóides induziram perda de potencial de membrana mitocondrial (Δψm), mas apenas o 2-AG levou a um aumento na formação de ROS/RNS, sem terem sido observadas diferenças nos níveis de glutationa. O stress reticular pode estar envolvido no stress oxidativo induzido pelo 2-AG, visto que resultados preliminares apontam para um aumento na expressão de CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein (CHOP). Para além da diminuição da viabilidade celular, os resultados sugerem alterações na progressão do ciclo celular. O tratamento com WIN induziu retenção do ciclo celular em fase G0/G1, enquanto que o 2-AG levou a uma retenção em fase G2/M. Neste trabalho é reforçada a importância da sinalização canabinóide em processos importantes de proliferação e morte celular de células trofoblásticas. Visto que as drogas canabinóides são as mais consumidas a nível mundial, e umas das drogas recreativas mais consumidas pelas mulheres grávidas, este estudo pode contribuir para a compreensão do impacto destas substâncias na reprodução humana