Small molecule inhibitors sensitize neuroblastoma cells for chemotherapeutic drug-induced apoptosis

Das Neuroblastoma (NB) ist eine der gängigsten pädiatrischen Tumorarten, welche sich aus undifferenzierten Zellen des peripheren, sympathischen Nervensystems entstehen. Ungefähr 8-10% aller Kindheitstumore macht das Neuroblastoma aus. In Tumoren, die als Stufe 3 und 4 des internationalen Klassifizierungssystem (INSS) klassifiziert sind, sind die Aussichten auf Heilung relativ schlecht, obwohl aggressive Chemotherapie und Radiotherapie zur Behandlung eingesetzt werden. Von daher ist es bedeutend, neuartige Behandlungsstrategien zu endwickeln und bestehende zu verbessern. Eine Methode, hohe chemotherapeutische Effekte zu erzielen, besteht darin, Patienten Krebsmedikamente in jeweils nicht-toxischen, niedrigen Dosen zu verabreichen. Dabei werden nicht nur die Erfolge der Chemotherapie erhöht, sondern auch mögliche Nebenwirkungen wie zum Beispiel Kardiotoxizität reduziert. In dieser zweiteiligen Studie konnten wir zeigen, dass der Einsatz von sogenannten small molecule Inhibitoren (SMI) Neuroblastomzellen für gängige chemotherapeutische Medikamente, die Zelltod induzieren können, sensitiviert. Zum einen kombinierten wir Vincaalkaloide mit einem Inhibitor der Polo-like kinase 1 (PLK1) und zum anderen benutzten wir die Kombination aus BV6, einem SMAC Mimetikum mit Doxorubicin (DOX) oder Vincristin (VCR). Letzteres gehört zu den anti-mitotischen Medikamenten, welche Zellzyklus-Arrest durch die Destabilisierung der Mikrotubuli verursacht. DOX hingegen hemmt die Funktion der Topoisomerase II und blockiert somit die Replikation und die Transkription der DNS. BI 2536 ist ein PLK1-Inhibitor und blockiert die Kinase-Funktion, indem es die ATP-Bindestelle besetzt. Das bivalente SMAC Mimetikum BV6 wiederrum führt zur Degradierung der inhibitor of apoptosis proteins (IAPs), was letztendlich in der Aktivierung von Caspasen resultiert. Im Vergleich zur Monotherapie mit letztgenannten Medikamenten, veranschaulichen wir, dass die Kombinationstherapie den Zelltod synergistisch verstärkte. Die Fragmentierung der DNS, ausgelöst durch Einzel- wie auch Kombinationsbehandlung, wurde dabei mittels Durchflusszytometrie analsysiert. Außerdem konnte in Langzeitversuchen nachgewiesen werden, dass auch die Viabilität der Neuroblastomzellen signifikant reduziert wird. Ko-Behandlung mit Vincaalkaloiden und SMI führte zu mitotischem Arrest, was in der Western Blot Analyse anhand der Phosphorylierung von Histon H3 nachgewiesen wurde. Diese Phosphorylierung resultierte in der Induktion von intrinsischer Apoptose, war jedoch durch die Inhibition der Zellzyklus-Kinase CDK1 aufgrund von Zugabe des pharmakologischen Inhibitors RO-3306 reversibel. Mitotischer Arrest führte zur Degradierung anti-apoptotischer Proteine wie MCL-1, beziehungsweise zur Phosphorylierung und Inaktivierung der anti-apoptotischen Proteine BCL-2 und BCL-XL. Die Inaktivierung von BCL-2 wiederrum, war durch die Aktivierung der pro-apoptotischen Proteine BAX und BAK begleitet. Dass der mitochondriale Apoptose-Signalweg so bedeutend für den Vincaalkaloid/SMI-induzierten Zelltod ist, wurde ferner durch weitere Experimente bestätigt. Ektopische Überexpression von BCL-2 reduzierte die verursachte DNS-Fragmentierung, verhinderte die BAK-Aktivierung sowie die Spaltung der Caspase-3 und Caspase-9. Im Unterschied zur Vincaalkaloid/SMI-vermittelten Apoptose steht die Doxorubicin/BV6-vermittelte, da mitochondriale Signalwege nur eine untergeordnete Rolle spielten. Stattdessen konnten wir darlegen, dass die Kinase RIP1 eine Schlüsselrolle spielt. Durch Inhibition von RIP1 mithilfe pharmakolgischer und genetischer Mittel wurde die Apoptose signifikant reduziert. In vergangenen Studien wurde gezeigt, dass besonders der Transkriptionsfaktor NF-kB sowie auto-, beziehungsweise parakrine TNFa-Produktion induziert werden, sobald Proteine wie cIAP1 oder cIAP2 nach Behandlung mit SMAC Mimetika abgebaut werden. Im Modell, das für diese Arbeit gewählt wurde, war der Zelltod, induziert durch die Behandlung mit dem SMAC Mimetikum BV6 in Kombination mit Vincristin oder Doxorubicin, weder durch den NF-kB- noch durch den TNFa-Signalweg reguliert. Dies konnte nachgewiesen werden, in dem zum einen ein gegen TNFa-gerichteter Antikörper, und zum anderen Zellen, die eine dominant-negative Form von IkBa exprimieren, benutzt wurden. Beide angewandten Methoden verringerten den DOX/BV6-vermittelten Zelltod nicht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zwei vielversprechende Behandlungsmethoden für Neuroblastompatienten gefunden wurden, welche daraus bestand, verschiedene SMI mit gängigen Krebsmedikamenten zu kombinieren. Außerdem wurden die Signalwege, die zur Apoptose führen, detailliert charakterisiert. Interessanterweise besitzt dabei die Kinase RIP1 im DOX/BV6-vermitteltem Zelltod eine unterschiedliche Rolle als im mitochondrialen Apoptose-Signalweg, induziert durch Vincaalkaloide und BV6 oder BI 2536. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Behandlungsstrategien, Thema dieser Arbeit, klinische Relevanz besitzen, da zum einen der Effekt von BI 2536/VCR-Behandlung auch in einem in vivo Tumormodell signifikant nachgewiesen wurde, und zum anderen die Behandlung von BV6 mit DOX oder VCR an nicht-bösartigen, humanen Blutzellen keinen Zelltod auslösten. Dies erbrachte somit den Nachweis einer gewissen Tumorselektivität.Neuroblastoma (NB) is one of the most common solid extracranial pediatric tumors, deriving from undifferentiated cells of the peripheral nervous system. It accounts for approximately 10% of all childhood cancers. High stage tumors usually show poor prognosis despite aggressive treatment such as radiotherapy or chemotherapy. Therefore, it is of utmost importance to find novel treatment strategies in order to improve existing chemotherapy protocols. Combination treatment offers advantages, as chemotherapeutic drugs can be applied in low and subtoxic doses, reducing possible side-effects. Here, we report in a two-part study that small molecule inhibitors (SMI), namely BI 2536, a PLK1 inhibitor and BV6, a SMAC mimetic (SM), sensitize neuroblastoma cells for chemotherapeutic drug-induced cell death. By using i) BI 2536 in combination with vinca alkaloids and ii) BV6 in combination with either doxorubicin or vinca alkaloids, we show that cell death is synergistically enhanced compared to monotherapy. Furthermore, combination treatment significantly reduces survival of NB cells in long-term assays, compared to single treatment. We identify that vinca alkaloid/SMI combinations induce mitotic arrest, as shown by phosphorylation of histone H3, which results in the induction of intrinsic apoptosis and inhibition of CDK1 by RO-3306 could abolish these findings. Mechanistically, upon vinca alkaloid/SMI-induced mitotic arrest, anti-apoptotic BCL-2 proteins such as MCL-1, BCL-2 or BCL-XL are degraded or inactivated by phosphorylation, which induces the activation of the proapoptotic BCL-2 family proteins BAX and BAK. The importance of the mitochondrial apoptosis pathway in vinca alkaloid/SMI-induced cell death was further highlighted by the fact that ectopic expression of BCL-2 inhibits vinca alkaloid/SMI-induced DNA fragmentation and BAK- and caspase-activation. In contrast to the vinca alkaloid/SMI cotreatment, DOX/SMI (DOX/BV6)-induced apoptosis only partially involves the mitochondrial pathway. Instead, we clarify that RIP1 is required for DOX/BV6-induced apoptosis, as pharmacological and genetic inhibition of RIP1 rescues from apoptosis induction. Although it has been shown in previous studies that SM-treatment (e.g. BV6) can induce the NF-κB pathway and auto-/paracrine TNFα production through cIAP1/2 depletion, DOX/BV6-induced apoptosis is completely independent of NF-κB activation in our setting, despite fast cIAP1 depletion. This conclusion is based on the fact that inhibition of the NF-κB pathway by exogenously expressed dominant-negative IκBα as well as application of a TNFα blocking antibody does not reduce DOX/BV6-induced cell death. In summary, we unravel two new promising treatment strategies for neuroblastoma patients by using a combination treatment of two different small molecule inhibitors, combined with well-characterized chemotherapeutic agents. Furthermore we give detailed insights into cell death pathways induced by these combination treatments, in which mitochondria and RIP1 have a differential role in chemotherapeutic drug-induced apoptosis