Smac mimetics synergize with glucocorticoids to induce cell death in pediatric acute lymphoblastic leukemia

Resistance in glucocorticoid-induced apoptosis is associated with poor prognosis for long term survival in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). As Smac mimetics have been shown to reactivate apoptosis by antagonizing Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins, we investigate the potential of the Smac mimetic BV6 to overcome glucocorticoid-resistance in ALL. This study shows that BV6 synergistically cooperates with glucocorticoids to trigger apoptosis and to suppress clonogenic growth of pediatric ALL cells. Of note, the BV6/glucocorticoid combination treatment also induces cell death in cells having defects in the apoptotic signaling cascade by inducing a switch from apoptotic to necroptotic cell death. The clinical relevance of our novel combination treatment is underscored by parallel experiments in primary pediatric ALL samples, in which glucocorticoids and BV6 act together to induce cell death in a synergistic manner. Importantly, the addition of BV6 enhances the anti-leukemic effects of glucocorticoids in an in vivo mouse model of pediatric ALL without causing substantial side effects, highlighting the potency of a BV6/glucocorticoid combination treatment. In contrast, BV6 does not increase cytotoxicity of glucocorticoids against several non-malignant cell types of the lympho-hematopoietic system. Furthermore, we have identified the novel underlying mechanism of BV6/glucocorticoid-induced apoptosis by showing that BV6 and glucocorticoids synergistically act together to promote assembly of the ripoptosome, a RIP1/FADD/caspase-8-containing cell death complex. Ripoptosome assembly is critically required for BV6/Dexamethasone-induced cell death, since genetic silencing of its members, i.e. RIP1, reduces ROS production, caspase activation and most importantly cell death induction. BV6/glucocorticoid combination treatment promotes ripoptosome assembly by inhibition of both of its negative regulators, IAP proteins and cFLIP. Thus, we identify that BV6 and glucocorticoids cooperate together to reduce cIAP1, cIAP2 and XIAP protein levels and cFLIP expression. Ripoptosome formation occurs independently of autocrine/paracrine loops of death receptor ligands, since blocking antibodies for TNFα, TRAIL or CD95L or genetic silencing of their corresponding receptors fail to rescue BV6/glucocorticoid-induced cell death. In summary, this study shows that the Smac mimetic BV6 sensitizes for glucocorticoid-induced apoptosis by promoting ripoptosome assembly with important implications for the treatment of childhood ALL.Leukämie gehört mit 34% zu den am häufigsten diagnostizierten Krebserkrankungen im Kindesalter. Akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist mit einer Inzidenz von 80% die am meisten auftretende Leukämieform. Aufgrund ihrer Fähigkeit effizient Tumorzellen zu töten, sind Glukokortikoide wesentliche Bestandteile der multi-modalen Chemotherapie in der Behandlung für ALL. Sensitivität gegenüber Glukokortikoiden ist ein wichtiger prognostischer Marker in der pädiatrischen Leukämie. Da Apoptose der hauptsächliche Zelltodmechanismus ist, der durch Glukokortikoide induziert wird, trägt eine Resistenz gegenüber der Glukokortikoid-induzierten Apoptose wesentlich zur schlechten Prognose und einem ungünstigem Krankheitsverlauf bei. Deswegen sind neue Therapiestrategien, bei denen apoptotische Signalwege reaktiviert werden, von entscheidender Bedeutsamkeit bei der Behandlung von Glukokortikoid-resistenter ALL. Apoptose gehört zu den am Besten charakterisiertesten Zelltodmechanismen und ist ein wichtiger Prozess in der Hämatopoese von Lymphozyten. Aufgrund des Apoptose-auslösenden Stimulus, können zwei verschiedene Apoptosesignalwege unterschieden werden, der Todesrezeptorvermittelte (oder auch extrinsische) und der mitochondriale (oder auch intrinsische) Signalweg. Inhibitor of Apoptosis (IAP) Proteine sind wichtige Negativregulatoren des Apoptosesignalweges. Dabei inhibiert XIAP durch Bindung mit seiner BIR Domäne die Aktivierung von Caspase-9, Caspase-3 und Caspase-7, während cIAP1 und cIAP2 prädominierend über ihr E3 Ligase Aktivität der RING Domäne Proteine wie RIP1 ubiquitiniert und damit Zelltodsignalwege hemmt. Aufgrund der Tatsache das IAP Proteine häufig in verschiedenen Krebsentitäten dereguliert sind, wurden pharmakologische Inhibitoren, so genannte Smac mimetics, entwickelt. Smac mimetics sind relativ kleine Moleküle, die das N-terminale Bindungsmotiv von Smac, einem endogenen IAP Antagonisten nachahmen, und damit an IAP Proteine binden und diese dadurch in ihrer Aktivität hemmen. Während Bindung von Smac mimetics an cIAP Proteine zu deren proteasomalen Degradation über Aktivierung der E3 Ligase und Autoubiquitinierung führt, inhibieren Smac mimetics die durch XIAP vermittele Hemmung auf Caspasen, wodurch diese aktiviert werden können. Ergebnisse von präklinischen und klinischen Studien belegen, dass Smac mimetics insbesondere bei Kombinationstherapien sehr effektiv sind, um Apoptosesignalwege zu reaktivieren und dadurch Krebszellen für die Chemotherapie-induzierte Apoptose zu sensitivieren. In der folgenden Studie soll untersucht werden, ob man die Sensitivität gegenüber einer Glukokortikoid-basierten Therapie mit einer Kombinationsbehandlung mit dem Smac mimetic BV6 in der pädiatrischen ALL wieder herstellen kann und damit ALL Zellen empfänglich für Glukokortikoid-induzierte Apoptose machen kann. Die Indikation, dass Smac mimetics für eine Kombinationstherapie in der ALL geeignet sind ergibt sich aufgrund der Tatsache, dass ALL Zellen von Kindern mit einer Glukokortikoid-Resistenz eine erhöhte Expression von IAP Proteinen aufweisen, was mit einer schlechten Prognose und Therapieresistenz assoziiert ist. Eine erhöhte XIAP Protein Expression steht ebenfalls in Verbindung mit einem schlechten Ansprechen auf eine Prednisontherapie von ALL Patienten und erhöhte cIAP Protein Levels können in der pädiatrischen ALL detektiert werden. Unsere Experimente belegen, dass die Kombination von Glukokortikoiden, wie z.B. Dexamethason und Prednisolon, mit dem Smac mimetic BV6 zur synergistischen Zelltodinduktion in pädiatrischen ALL Zellen führt, die eine initiale Resistenz gegenüber Glukokortikoiden aufweisen. Eine synergistische Wirkung der BV6/Glukokortikoid-Kombinationstherapie konnte nicht nur in ALL Zelllinien, sondern auch in primären Tumorproben von pädiatrischen ALL Patienten bestätigt werden. Bemerkenswerterweise trat der durch BV6/Glukokortikoid-induzierte synergistische Zelltod ebenfalls bei primären ALL Zellen auf, die von Patienten mit einer Hochrisiko-Erkrankung und einem Rezidiv stammen. Zudem belegt unsere Studie, dass BV6 auch die Dexamethason-induzierte Zytotoxizität in einem in vivo Mausmodell für pädiatrische ALL erhöht, ohne dabei substanzielle Nebenwirkungen zu verursachen. Die klinische Relevanz der BV6/Dexamethason- Kombinationstherapie wird durch die Tatsache belegt, dass BV6 und Dexamethason synergistisch Zelltod in ALL Zellen auslösen, während nicht-maligne Zellen des lymph-hämatopoietischen Systems nicht betroffen sind. So kann BV6 nicht den Glukokortikoid-induzierten Zelltod in peripheren Blutzellen, in mesenchmalen Stromazellen und in CD34-positiven Vorläuferzellen potenzieren. Außerdem hat die BV6/Dexamethason-Kombinationstherapie keinen Effekt auf die Differenzierung von Monozyten zu CD86-positiven Dendritischen Zellen. Durch diese Ergebnisse wird belegt, dass die Behandlung mit BV6 und Glukokortikoiden in Kombination ein therapeutisches Fenster besitzt, wodurch synergistisch Zelltod in pädiatrischen ALL Zellen ausgelöst werden kann, während bei äquimolaren Konzentrationen nicht-maligne Zellen des lymph-hämatopoietischen Systems verschont bleiben. Bei dem durch BV6/Dexamethason-induzierten Zelltod handelt es sich dabei um Apoptose, da BV6/Dexamethason synergistisch zusammenwirken, um typische Bestandteile der apoptotischen Signalkaskade zu aktivieren. So bewirkt eine BV6/Dexamethason-Kombinationsbehandlung eine vermehrte Aktivierung von Caspasen, Aktivierung der proapoptotischen Proteine Bax und Bak, Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials, Freisetzung von Cytrom C aus dem Mitochondrium in das Zytosol und DNA-Fragmentierung. Ergebnisse dieser Studie zeigen neben der Entdeckung der neuartigen Kombinationstherapie, auch den zugrunde liegenden Mechanismus des durch BV6/Dexamethason-ausgelösten Apoptose. So kann belegt werden, dass BV6 und Dexamethason zusammen zur Bildung und Aktivierung des Ripoptosomes führen. Das Ripoptosome ist ein zellulärer Komplex, bestehend aus RIP1/FADD/Caspase-8 und dessen Bildung und Aktivierung führt zur proteolytischen Prozessierung von Caspase-8 in seine aktive Form, wodurch letztendlich der Apoptosesignalweg induziert wird. Immunopräzipitations-Experimente aus dieser Studie belegen, dass es durch eine BV6/Dexamethason-Kombinationsbehandlung zur vermehrten Assoziation von RIP1 an FADD und Caspase-8 kommt. Da Studien belegen, dass eine Assemblierung des Ripoptosomes insuffizient für dessen Aktivierung ist, zeigen wir zudem, dass BV6/Dexamethason neben der Bildung auch die Aktivität des Ripoptosomes potenzieren. Dies wird bewiesen durch (1) eine erhöhte Caspasenaktivität nachgewiesen durch deren Spaltung in die aktive enzymatische Form mit der daraus resultierender Aktivierung von untergeordneten Signalwegkaskaden, wie z.B. einem Verlust des mitochondrialen Membranpotenziales, einer Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium in das Zytosol und DNA-Fragmentierung. Des Weiteren kann gezeigt werden, dass es (2) durch genetische Runterregulation der Bestandteile des Ripoptosomes, wie z.B. RIP1 und Caspase-8, zu einer Inhibition der Caspasen-Aktivierung und einer daraus resultierenden Reduktion des apoptotischen Zelltodes kommt. Diese Experimente zeigen ebenfalls, dass die Assemblierung des Ripoptosomes ein proximales Ereignis ist, da die Störung dessen Bildung die Aktivierung von untergeordneten Apoptosesignalwegen verhindert. Ripoptosome Bildung und Aktivierung wird in der Regel durch zwei verschiedene Negativmodulatoren reguliert: IAP und cFLIP Proteine. IAP Proteine modulieren dabei die Verfügbarkeit der Ripoptosome-Komponenten durch deren Ubiquitinierung. So können cIAP Proteine RIP1 an K48-Resten ubiquitinieren und für dessen proteasomale Degradation sorgen oder wahlweise durch K63-Ubiquitinierung RIP1 an Rezeptor-Komplexe binden, um eine TNFα-induzierte Aktivierung des NF-κB Signalweges zu bewirken. In Abwesenheit von cIAP Proteinen, liegt jedoch RIP1 im unubiquitinierten Zustand vor und kann sich der cIAP-Protein vermittelten proteasomalen Degradation oder der Lokalisation am Rezeptorkomplex entziehen, wodurch es zellulär verfügbar wird, zusammen mit Caspase-8 und FADD das Ripoptosome zu bilden. Smac mimetics wie BV6 haben schon in vorherigen Studien belegen können, dass sie effektiv zur Reduktion von IAP Porteinen, insbesondere von cIAP1 und cIAP2 führen. Auch für Glukokortikoide, wie Dexamethason gibt es Belege, dass sie Proteinlevel von IAP Proteinen modulieren können, jedoch sind diese Daten teilweise sehr widersprüchlich. So konnte in einer Studie aufgeführt werden, dass Dexamethason zur Degradation von XIAP und cIAP1 führt, während ebenfalls belegt werden konnte, dass Dexamethason zur Hochregulation von cIAP2 führt. Unsere Studie ist die erste, in der gezeigt werden kann, dass BV6 und Dexamethason synergistisch interagieren, um IAP Proteine zu reduzieren. Wir suggerieren, dass dabei beide Substanzen synergistisch zur proteasomalen Degradation der IAP Proteine führen, weil der Proteasominhibitor Bafilomycin die durch BV6/Dexamethason-induzierte Reduktion von IAP Proteinen aufhebt. Dagegen zeigt der Autophagy-Inhibitor Bafilomycin und der Caspasen-Inhibitor zVAD.fmk keine Wirkung auf die BV6/Dexamethason-vermittelte Reduktion der IAP Proteine. Zusätzlich zu den IAP Proteinen, haben cFLIP Proteine inhibitorische Wirkung auf die Ripoptosome Aktivierung, indem z.B. cFLIPL mit Caspase-8 interagiert und deren volle Aktivierung blockiert. Unsere Studie zeigt, dass BV6 zu einer Vermehrten Expression von cFLIPL führt, diese aber in Kombination mit Dexamethason komplett aufgehoben wird. Zusätzlich zu Veränderungen auf Proteinebene, können wir zeigen, dass die Zugabe von Dexamethason den BV6-induzierten Anstieg in cFLIPL mRNA verhindert, was suggeriert, dass die BV6/Dexamethasone-Kombinationsbehandlung zur transkriptionellen Hemmung von cFLIPL führt. Da cFLIPL als ein durch NF- κB transkriptionell reguliertes Protein beschrieben ist, haben wir parallel zu der cFLIPL Expression auch die Aktivierung des NF- κB Signalweges analysiert. BV6 ist beschrieben als Einzelsubstanz sowohl den kanonischen als auch den nicht-kanonischen NF- κB Signalweg durch NIK Akkumulation und TNFα-Produktion zu stimulieren, während Dexamethason inhibierende Funktionen auf den NF-κB Signalweg hat. Unsere Studie zeigt, dass wenn beide Substanzen in einer Kombinationsbehandlung verwendet werden, primär die inhibierende Wirkung von Dexamethason auf den NF-κB Signalweg überwiegt. In Übereinstimmung mit bisherigen Studien, führt eine BV6 Einzelbehandlung zu einer Aktivierung des kanonischen, mit Phosphorylierung von IκBα, als auch des nicht-kanonischen Signalweges, mit vermehrter p100 zu p52 Prozessierung, sowie zu einer erhöhte NF-κB-DNA-Bindung im Vergleich zu Kontroll-behandelten Zellen. Im Gegensatz dazu, weisen Zellen die zusätzlich noch mit Dexamethason behandelt wurden, keine Aktivierung des NF-κB Signalweges auf, was durch fehlende Prozessierung von p100, Phosphorylierung von IκBα und reduzierte NF-κB DNA-Bindung belegt wird. Zusammenfassend lässt sich somit festhalten, dass es durch eine BV6/Dexamethason-Kombinationsbehandlung zu einer vermehrten Ripoptosome Bildung und Aktivität kommt, indem BV6 und Dexamethason zusammen IAP Proteine und cFLIPL als zwei Negativregulatoren des Ripoptosomes herunterregulieren. Die Bildung und Aktivierung des Ripoptosomes erfolgt dabei unabhängig von Todesrezeptorsignalwegen, da blockierende Antikörper gegen TNFα, TRAIL oder CD95L, die mit der Ligandenbindung an den Rezeptor interferieren, keinen Effekt auf den durch BV6/Dexamethason-induzierten Zelltod haben. Zudem führt eine genetische Runterregulation der korrespondierenden Todesrezeptoren zu keiner Veränderung im BV6/Dexamethason-ausgelösten Zelltod. Die Funktionalität der blockierenden Antikörper und der genetischen Runterregulation der korrespondieren Rezeptoren wird durch parallele Experimente mit entsprechenden positiv Kontrollen bewiesen, in denen die blockierenden Antikörper oder die genetische Runterregulation der Rezeptoren protektiv wirkt. Diese Daten belegen, dass es sich bei der Bildung des RIP1/FADD/Caspase-8 beinhaltendem Komplexes um das Ripoptosome und nicht um den Komplex II handelt, der per Definition zwar die gleichen Proteinen beinhaltet, aber abhängig von der Aktivierung der Todesrezeptoren gebildet wird. Zusammenfassend zeigte diese Studie zum ersten Mal, dass (1) Smac mimetics und Glukokortikoide synergistisch Apoptose in pädiatrischen ALL Zellen in vitro und in vivo auslösen, während nicht-maligne Zellen des lymph-hämatopoietischen Systems verschont bleiben, und dass (2) Smac mimetics und Glukokortikoide zusammen die Bildung und Aktivierung des Ripoptosomes, eines RIP1/Caspase-8/FADD beinhaltendem Komplexes, bewirken, was subsequent zur Aktivierung von Caspase-8 und dadurch zur Induktion des apoptotischen Zelltodes führt. Abschließend lässt sich festhalten, dass die Ergebnisse aus dieser Studie wichtige Implikationen für zukünftige Therapiestrategien in der Behandlung der pädiatrischen ALL haben, dass jedoch die Potenz der aus Smac mimetic und Glukokortikoiden bestehende Kombinationsbehandlung und sowie deren Nebenwirkungen in weiteren, insbesondere klinischen Studien getestet werden muss