Contribution to the epidemiological study of Anaplasma phagocytophilum in wild cervids and suids in Wallonia.

Anaplasma phagocytophilum is the aetiologic agent of the human granulocytic anaplasmosis (HGA). This tick-borne pathogen has acquired a particular importance in public and veterinary health in the United States and in Europe during these last two decades and HGA is now considered as an emerging disease. Both ticks as vectors and vertebrates as reservoir hosts are essential for the cycle maintenance of this bacterium. Currently, the whole range of animal species reservoirs for A. phagocytophilum in natural environment is still unknown. Therefore, the aim of this study was to estimate the prevalence of infection with A. phagocytophilum in the wild populations (cervids and suids) living in southern Belgium. In the frame of a targeted surveillance program, 854 cervids and 513 wild boars were sampled during the hunting seasons 2006, 2011 and 2012. Serums samples from cervids (2006 and 2012) were analyzed for A. phagocytophilum antibodies using an Indirect Fluorescence Assay (IFA) test. Spleens of the hunting seasons 2011 (boars) and 2012 (cervids) were randomly selected and tested for the presence of A. phagocytophilum DNA using a 16S rRNA nested PCR. In red deer, A. phagocytophilum IgG antibodies were detected in 118 of the 315 [37.5% (32.2 - 42.8)] and in 61 of 190 [32.1% (25.5 - 38.7)] serum samples collected in 2006 and 2012 hunting seasons respectively. In roe deer, 101 of 106 [95.3% (92.6 - 99.8)] and 214 of 243 [88% (83.9 - 92.1)] serums sample collected in 2006 and 2012 hunting seasons contained A. phagocytophilum IgG antibodies. Within 384 spleens tested from cervids, the PCR yielded the expected 641 bp fragment of A. phagocytophilum DNA in 79 of 84 samples of red deer (94%) ´and in 245 of 300 samples of roe deer (81%). In contrast, 5 of 513 samples of wild boar (0.97%) were tested PCR positive. Sequencing of a subset of these amplicons revealed a single allele with 100% identity with 43 Genbank entries, all from A. phagocytophilum strains : 2 originated from human cases and others from animals including strains isolated in Poland from red deer (CE18, Genbank accession number GQ450278.1) and fallow deer (Dama 35, Genbank accession number GQ450276.1). In conclusion, this study gives the first insight of presence of A. phagocytophilum in wild cervids and suids populations in southern Belgium. These wild species, and specially the roe deer and wild boar, could be used as sentinels in epidemiologic studies related to HGA. However, further studies are needed to determine if variant strains of A. phagocytophilum present in wildlife are human-infective strains.Au cours des vingt dernières années, de nombreuses études ont souligné l’importance croissante des maladies vectorielles. Au sein des arthropodes, les tiques occupent la deuxième place, après les moustiques, en tant que vecteurs d’agents pathogènes. L’anaplasmose granulocytaire humaine est une zoonose transmise par des tiques et dont l’agent responsable est Anaplasma phagocytophilum, une bactérie intracellulaire obligée qui infecte essentiellement les granulocytes neutrophiles. L’anaplasmose granulocytaire est considérée comme une maladie émergente qui suscite l’intérêt du monde scientifique. Jusqu’à présent, de nombreuses études ont été réalisées aussi bien sur les tiques vectrices d’A. phagocytophilum que sur les différentes espèces animales considérées comme réservoirs. Mais il reste actuellement beaucoup d’inconnues quant aux multiples mammifères sauvages qui hébergent cette bactérie et qui pourraient être considérés comme réservoirs potentiels. Dans ce contexte, les objectifs généraux de cette thèse étaient de déterminer si A. phagocytophilum circule au sein des populations de cervidés sauvages (cerfs et chevreuils) présents dans la zone d’étude (Région wallonne), si ces espèces sont des réservoirs compétents pour A. phagocytophilum et enfin si ces espèces peuvent être utilisées comme sentinelles sanitaires pour la surveillance spécifique de l’anaplasmose granulocytaire humaine. En outre, vu les populations importantes de suidés sur l’ensemble de la région, l’espèce sanglier a été la troisième espèce cible incluse dans l’étude. Pour remplir ces objectifs, des prélèvements ciblés (sang et rate) ont été réalisés sur les espèces cibles dans le cadre du programme de surveillance active mis en œuvre par le réseau de surveillance décrit dans la première étude. En 2006 puis 2011 et 2012, 854 cervidés et 513 sangliers ont été prélevés au sein des 33 unités géographiques couvrant la zone d’étude. Les échantillons ont été identifiés en fonction de l’espèce, de l’âge, du sexe de l’animal ainsi que de la date et du lieu de prélèvement. Un test d’immunofluorescence indirecte a été réalisé sur sérum pour détecter les anticorps anti A. phagocytophilum et une PCR 16S (qui permet d’amplifier un fragment du gène qui code pour le RNA ribosomal 16S) a été mise en œuvre sur les échantillons spléniques. Une partie des amplicons obtenus a été séquencée. Les enquêtes menées en cervidés ont montré que la séroprévalence apparente globale, en 2006 et 2012, était respectivement de 95% et 88% pour l’espèce chevreuil et de 37% et 32% pour l’espèce cerf. Les résultats PCR ont révélé que 94% des cerfs (79 sur 84) et 81% de chevreuils (245 sur 300) étaient infectés par A. phagocytophilum et que les résultats positifs étaient uniformément répartis sur l’ensemble de la zone d’étude. Par contre, le taux d’infection des sangliers était très faible puisque moins de 1 % des rates étaient PCR positives. En conclusion, nous avons montré pour la première fois en Belgique qu’A. phagocytophilum circulait de manière endémique au sein des populations de cervidés sauvages vivant en Région wallonne. Deux enquêtes sérologiques ont fourni les premiers indices de présence de cette bactérie chez des cerfs et chevreuils. Les analyses PCR ont ensuite révélé que ces deux espèces étaient fortement infectées par A. phagocytophilum par opposition aux sangliers qui présentaient des taux d’infection très faibles. Sur l’ensemble des résultats PCR positifs, les 25 amplicons séquencés étaient identiques quelle que soit l’origine de l’espèce (cerf, chevreuil ou sanglier) et ils présentaient 100% de similitude avec 2 souches d’origine humaine et plusieurs souches d’origine animale. Des études supplémentaires, qui ciblent les gènes ankA et groESL, sont nécessaires pour déterminer si les variants d’A. phagocytophilum qui circulent en faune sauvage sont pathogènes pour l’homme. Le cas échéant, chevreuil et sanglier devraient être considérés comme espèces sentinelles sanitaires pour la surveillance spécifique de l’anaplasmose granulocytaire humaine