(Bio)funcionalização de superfícies nanoestruturadas para eletrocatálise e desenvolvimento de biossensores eletroquímicos e óticos

Tese de doutoramento, Química (Química Física), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016A descoberta de novos métodos, simples e robustos, de imobilização de biomoléculas conjugadas com nanomateriais em superfícies metálicas, surge devido à necessidade de melhorar o desempenho das interfaces biossensoras atualmente existentes, tornando-as mais estáveis, versáteis e eficientes para a deteção de compostos alvo. Na presente tese foram exploradas metodologias diretas, de um só passo reacional, para imobilização de biomoléculas em superfícies de ouro, baseadas na formação in situ de ditiocarbamatos, com o intuito de utilizá-las como plataformas para biossensores. Para tal estudou-se a reatividade entre o dissulfureto de carbono e grupos amina presentes em moléculas pequenas (epinefrina), em aminoácidos (triptofano) e em enzimas (glucose oxidase e lacase). Estas reações foram efectuadas na presença de nanopartículas com vários tamanhos médios: Pt (3 nm), Au (5, 20 nm) e Fe3O4 (20 e 40 nm), em meio orgânico e aquoso. A funcionalização das nanopartículas e a imobilização estável dos (bio)compostos estudados na superfície de ouro, foi confirmada por ensaios eletroquímicos (voltametria cíclica, cronoamperometria), por espectroscopia fotoeletrónica de raios-X e microscopia de força atómica. A atividade catalítica dos elétrodos nanoestruturados modificados com glucose oxidase e lacase foi avaliada, electroquimicamente, para a oxidação da glucose e do ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico). O dissulfureto de carbono foi igualmente utilizado para ligar nanopartículas de magnetite (20 e 40 nm), em superfícies de ouro, funcionalizadas com metaloporfirinas de Fe e Co que possuem grupos funcionais específicos com afinidade para superfícies de óxidos metálicos. Esta modificação simples e versátil permitiu estudar com sucesso a reação de redução de oxigénio (ORR), em meio acídico. Desta forma, provar demonstrou-se a estabilidade das nanopartículas de magnetite conjugadas com metaloporfirinas em soluções ácidas, revelando o seu potencial como uma alternativa à utilização de catalisadores à base de platina para a ORR. A funcionalização das nanopartículas foi demonstrada por espectroscopia de UV – visível enquanto os ensaios com o elétrodo rotativo de disco e anel, revelaram a existência de dois mecanismos diferentes para a ORR, via 2 ou 4 eletrões, dependendo do centro metálico, Co ou Fe, das metaloporfirinas. A metodologia de modificação de superfícies nanoestruturadas de ouro com base na formação in situ de ditiocarbamatos (CS2 e proteína A) foi também testada na preparação de interfaces para imunossensores. Ficou demostrado, por ressonância de plasmão de superfície, elipsometria convencional e de imagem em modo de reflexão interna total, que esta interface apresenta capacidade para detetar fenómenos de bioespecificidade (Imunoglobulina G - Anti-Imunoglobina G), com a vantagem de inibir a adsorção de proteínas ligadas inespecificamente. Foi ainda apresentada uma abordagem completamente inovadora de preparação de biointerfaces muito sensíveis, baseadas na deposição direta de bicamadas lipídicas suportadas em ouro. Para este propósito depositaram-se vesículas que contêm misturas de dois lípidos comuns (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina e colesterol) e um alcanotiol, que provaram formar bicamadas robustas, com elevada capacidade para inibir a adsorção não específica de proteínas, permitindo ainda o acoplamento covalente de anticorpos. Esta nova plataforma apresenta-se como uma alternativa com elevado potencial à utilização de tiolipídos tipicamente usados no desenvolvimento de plataformas imunossensoras.The research for new, simple and robust methods to immobilize biomolecules conjugated with nanomaterials on metal surfaces arises from the need to improve the performance of the current biosensing interfaces. The purpose is to make these biosensing interfaces more stable, versatile and efficient for the detection of target compounds. In this thesis, simple and one-step methodologies were explored for the immobilization of biomolecules on gold surfaces, based on the in situ formation of dithiocarbamates, in order to use them as a biosensors. The reactivity between carbon disulfide and amine groups present in small molecules (epinephrine), aminoacids (tryptophan) and enzymes (glucose oxidase and laccase) was studied. These reactions were carried out in the presence of nanoparticles of various average sizes, Pt (3 nm), Au (5, 20 nm) and Fe3O4 (20, 40 nm), in organic and aqueous media. The functionalization of nanoparticles and the stable immobilization of the (bio)compounds studied on the gold surface was confirmed by electrochemical techniques (cyclic voltammetry, chronoamperometry), X-rays photoelectron spectroscopy and atomic force microscopy. The catalytic activity of the modified nanostructured electrode with glucose oxidase and laccase was electrochemically evaluated towards glucose and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), respectively. Carbon disulfide was also used to attach magnetite nanoparticles (20 and 40 nm) functionalized with metalloporphyrins (Fe and Co) containing specific groups with affinity for metal oxide surfaces, to gold electrodes. This simple and versatile modification allowed to study successfully the oxygen reduction reaction (ORR), in acidic medium. Thus, the stability of the metalloporphyrin/Fe3O4 nanoparticles conjugate in acidic solution was confirmed, showing its potential as an alternative to platinum-based catalysts for ORR. The functionalization of the magnetite nanoparticles was confirmed by UV – visible spectroscopy, while the rotating ring-disk electrode assays revealed the existence of two different mechanisms for ORR via 2 or 4 electrons transfer, depending on the Co or Fe centre of metalloporphyrins. The methodology to modify the nanostructured gold surfaces based on the in situ formation of dithiocarbamates (CS2 and protein A) was also tested for preparing immunosensing interfaces. It was demonstrated by surface plasmon resonance, conventional and total internal reflection imaging ellipsometry, that the biointerface has the ability to detect biospecific phenomena (Immunoglobulin G- Anti-Immunoglobulin G), with the advantage of inhibiting the non-specific adsorption of proteins. A completely novel approach to prepare sensitive biointerfaces, based on the direct deposition of lipid bilayers supported on gold is also presented. For this purpose, vesicles containing mixtures of two common lipids (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine and cholesterol) and an alkanethiol were deposited on gold and showed the formation of robust bilayers with a high capacity to inhibit non-specific protein adsorption, allowing the covalent coupling of antibodies. This new platform is presented as an alternative immunossensing interface without the need to use thiolipids, typically employed in the preparation of lipid bilayers on gold