Structure and function of bacterial spirosomes

L’enzyme acétaldéhyde-alcool déshydrogénase (AdhE) est une enzyme clé dans la physiologie et pathogénicité bactérienne. Cette enzyme est responsable de la conversion de l’acétyl-CoA en acétaldéhyde puis en éthanol au cours de la fermentation alcoolique en absence d’oxygène. Ces deux réactions sont associées à la régénération du NAD+ qui est essentielle pour la glycolyse. AdhE est composée de 2 domaines : le domaine N-terminal acétaldéhyde déshydrogénase (ALDH) et le domaine C-terminal alcool déshydrogénase (ADH). Cette enzyme bi-fonctionnelle est très conservée dans le règne bactérien et également chez d’autres micro-organismes tels que des algues vertes. L’enzyme AdhE est étudiée pour son implication dans la production de biocarburants mais également pour son rôle dans la pathogénicité bactérienne. Cette enzyme est communément retrouvée sous sa forme oligomérique appelée spirosome. Malgré l’intérêt porté au monomère AdhE, la structure et la fonction des filaments restent inconnues depuis leur découverte dans les années 1970.En fonction des ligands présents, les spirosomes d’Escherichia coli sont retrouvés dans 2 états distincts.Durant cette thèse, les structures de la conformation étendue et compacte ont été résolues à haute résolution par cryo-microscopie électronique. A partir des structures obtenues, des mutants d’AdhE ont pu être générés afin d’empêcher la filamentation et ainsi d’étudier son rôle. Nous avons montré que les spirosomes contiennent des monomères d’AdhE actifs et que la filamentation est essentielle à son activité in vitro et in vivo. Lors de l’analyse de la structure étendue, nous avons identifié un canal dans le spirosome qui serait responsable de la canalisation de l’intermédiaire toxique qu’est l’acétaldéhyde. Comme d’autres exemples de filamentation d’enzymes ou de micro-compartiments enfermant des déshydrogénases, les spirosomes sont une forme de compartimentation bactérienne. Dans le but de l’étudier plus en détails, des expériences d’immuno-marquages ont été réalisées afin de localiser les filaments d’AdhE à l’intérieur de la bactérie. Ces observations ont révélé une localisation périphérique de la protéine sauvage d’AdhE alors que la protéine mutante non-filamentaire présente une localisation diffuse. Même si cette observation ne peut encore être expliquée, elle pourrait suggérer une différence de fonction entre la forme oligomérique et monomérique.La structure des spirosomes de Streptococcus pneumoniae a aussi été résolue par cryo-ME. Ces filaments sont toujours purifiés sous leur forme étendue. Cette structure est hautement similaire à celle obtenue pour E. coli dans leur conformation étendue. Les spirosomes de S. pneumoniae semblent être naturellement stabilisés en conformation étendue et donc active. Ceci pourrait être expliqué par les différences des séquences des deux protéines homologues.La détermination des structures des spirosomes d’E. coli et S. pneumoniae à haute résolution puis l’étude de la fonction révèlent que ces filaments sont indispensables à physiologie bactérienne en absence d’oxygène. L’étude de la régulation de l’activité des spirosomes pourrait mener à la découverte de molécules stimulant ou inhibant le changement de conformation des filaments d’AdhE d’ E. coli. Ces molécules pourraient présenter un intérêt en biotechnologie ou dans le but d’inhiber la croissance de micro-organismes anaérobies pathogènes.Acetaldehyde-alcohol dehydrogenase (AdhE) enzymes is a key metabolic enzyme in bacterial physiology and pathogenicity. They are responsible for the conversion of acetyl-CoA to ethanol via an acetaldehyde intermediate during ethanol fermentation in absence of oxygen. This two-step reaction is associated to NAD+ regeneration, essential for the glycolysis. This protein is composed of two domains: the N-terminal acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) domain linked to the C-terminal alcohol dehydrogenase (ADH) domain. This bifunctional AdhE enzyme is well-conserved in all bacterial kingdoms and also in more phylogenetically distant microorganisms such as green microalgae. AdhE is well-studied for its involvement in biofuel production, but as well for its role in bacterial pathogenicity. This enzyme is commonly found as an oligomeric form called spirosomes. Despite the great interest in the AdhE enzyme, the structure and function of these filaments remain unknown since their discovery in the 1970’s.Depending on ligands incubated with, Escherichia coli spirosome are found as two different conformational states.During this thesis, the structure of the extended and the compact conformation have been solved at high-resolution using cryo-electron microscopy.Based on these structures, AdhE mutants have been designed in order to disrupt the filamentation and study its role. We have shown that spirosomes contain active AdhE monomers and the AdhE filamentation is essential for its activity in vitro and in vivo. Again based on the obtained structure of the extended conformation, we identified that a channel within the filament which could be responsible for the channeling of the toxic acetaldehyde intermediate. Like other examples of metabolic enzyme filamentation or micro-compartments encapsulating dehydrogenases, spirosomes are a form of bacterial compartmentalization. In order to look deeper in this compartmentalization, immunolabelling experiments have been performed in order to localize AdhE filaments inside the bacteria. Observations revealed a peripheral localization for E. coli AdhE wild-type and a diffuse localization for the non-filamentous AdhE. These differences are not understood but might suggest a difference of function between oligomeric and monomeric form.The structure of the Streptococcus pneumoniae spirosome has also been solved using cryo-EM. Compared to E.coli spirosomes, AdhE filaments from S. pneumoniae have always been purified as extended conformation. S. pneumoniae spirosomes seem to be naturally found in extended conformation and so active form. This could be due to the differences present in the two homologous AdhE sequences.The determination of the E. coli and S. pneumoniae structures at high-resolution and the analysis of the function reveal that these filaments are required for bacterial physiology in absence of oxygen. The study of the regulation of spirosome activities might lead to the discovery of molecules stimulating or inhibiting conformation change in E. coli AdhE filaments. These molecules would present a great interest in biotechnology or to prevent pathogenic anaerobes