Identification des phosphorylations impliquées dans la regulation de l'activité du récepteur NPFF2

L'activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) induit la phosphorylation de résidus Serine (S) et Thréonine (T) de leurs domaines intracellulaires. Ces phosphorylations sont impliquées dans la désensibilisation du récepteur, son internalisation mais aussi dans le choix de la voie de signalisation activée. Le neuropeptide FF appartient à une famille de neuropeptides impliqués dans la modulation de l'activité analgésique des opioïdes en activant le récepteur NPFF2, un récepteur couplé aux protéines Gi. Afin d'étudier le rôle des phosphorylations induites par l'agoniste dans la régulation de l'activité du récepteur, nous avons déterminé par spectrométrie de masse le profil de phosphorylation des récepteurs humain et de rat exprimé dans les cellules SH-SY5Y. Les phosphorylations ont été identifiées dans l'extrémité C-terminale (T372/S373, S382, S386, S395, T412 et S414/T415) puis remplacés par des alanines et les récepteurs de rat mutés transfectés dans des cellules SH-SY5Y. La caractérisation fonctionnelle après mutagenèse des sites de phosphorylation nous a permis de montrer le rôle majeur des résidus TS372, 412TNST415 dans la désensibilisation du récepteur, et des résidus S395, 412TNST415 dans son internalisation. Pourtant, ces récepteurs restent capables de recruter la Béta-arrestine-GFP. Nous avons de plus montré le rôle de Gi et de la GRK2 dans la phosphorylation du récepteur. Ces résultats apportent une nouvelle preuve du rôle spécifique de la phosphorylation de résidus particuliers dans la régulation de l'activité des RCPG et permettent d'envisager la production d'anticorps phosphospécifiques destinés à l'étude in vivo de l'activation du récepteur NPFF2.GPCR activation induces the phosphorylation of Serine and Threonine residues in their intracellular domains. These phosphorylations are involved in receptor desensitization and internalization but can also determine the involved signaling pathway. Neuropeptide FF belongs to a neuropeptide family which modulates opioid analgesia by interacting with a Gi protein coupled receptor: the NPFF2 Receptor. In order to investigate the role of phosphorylation in the regulation of NPFF2R function, a mass spectrometry analysis was performed to characterize the agonist-induced phosphorylation pattern of the human and rat receptor expressed in SH-SY5Y cells. All phosphorylation sites were found in the carboxyl-terminus tail on T372/S373, S382, S386, S395, T412 and S414/T415. All the identified residues were mutated to Alanine and mutant rat receptors were expressed in SH-SY5Y cells. Functional characterization allowed us to identify the major, likely GRK-dependent, phosphorylation cluster responsible for acute desensitization, 412TNST415 at the end of the C-terminus of the receptor, as well as additional sites involved in desensitization (372TS373) and internalization (S395). The rat-specific residues seemed to be involved in G-protein coupling efficacy. These results bring new evidences of the specific role of the phosphorylation of particular residues in the regulation of GPCR activity. Furthermore, these results will enable us to generate phosphospecific antibodies that could be used in in vivo studies of NPFF2 receptor activation