Adeno associated virus TCID50 -infectious titer assay optimisation and use for titering of pre-clinical gene therapy product

Adeno-assosioituneista viruksista (AAV) on tullut viime vuosina eräs tutkituimmista geeniterapiavektoreista. Viranomaisten vaatimukset asettavat kliinisille lääkevalmisteille tiukat kriteerit, joiden mukaan valmisteen laatua ja ominaisuuksia on seurattava tuotannon aikana, sekä sen jälkeen. Valmisteen puhtautta, tehokkuutta ja turvallisuutta mittaavat analyysimenetelmät tukevat sekä viruksen tuotantoprosessia, että takaavat valmisteen laadun. TCID50-virustitrausmenetelmä on yleisesti viruksen infektiivisyyden mittaukseen käytetty menetelmä. Tässä maisterintutkielmassa AAV2 virustyypin referenssimateriaalin infektiivisyyden mittaamiseen käytetty TCID50 -protokolla optimoitiin ja osittain paranneltiin tutkimuslaboratorikäyttöön. Analyysimenetelmä perustuu HeLa-solulinjasta muokattuun klooniin, HeRC32 -pakkaussolulinjaan, joka adenoviruksen läsnä ollessa ekspressoi AAV:n Rep- ja Cap-proteiineja, jotka vaaditaan AAV-virusvektorin replikoitumiseen. Soluja kasvatettiin 96-kuoppalevyillä ja infektoitiin samanaikaisesti 10-kertaisesti laimennetuilla AAV-vektoreilla (AAV2 ja AAV6) ja adenovirus tyyppi 5:llä. Kolme vuorokautta infektion jälkeen replikoituneiden AAV-genomien määrä kuoppalevyn kaivoissa mitattiin kvantitatiivisella PCR:llä. PCR-syklien määrälle, sekä kopiomäärälle asetettiin raja-arvot, joiden perusteella kaivot määritettiin infektoituneiksi tai infektion suhteen negatiiviseksi. Positiivisten ja negatiivisten kaivojen lukumäärän perusteella määritetty 50-prosentin päätepiste (suurin laimennos, joka infektoi puolet sarjan kaivoista) sijoitettiin Spearman-Kärber yhtälöön, jolla infektiivisyystitteri laskettiin. Analyysimenetelmä optimoitiin kahdelle eri aluke-koetin parille hyväksikäyttäen AAV2-referenssimateriaalia. Kohdesekvenssit olivat SV40-polyadenylaatisignaali, sekä AAV:n vastakkaiset terminaaliset toistojaksot (ITR). AAV2 referenssimateriaalilla infektoidut kuoppalevyt analysoitiin erikseen kummallakin aluke-koetin parilla. SV40-koettimilla titteriksi saatiin of 8.07 ± 3.13 x 108 TCID50 Infectious Units (IU) / mL (n = 9) ja ITR -koettimilla 1.27 ± 0.464 x 109 TCID50 (IU)/mL (n = 9). Kun menetelmä oli optimoitu, sitä käytettiin pre-kliinisen AAV6 -vektorin analysointiin ITR -koettimilla. Titteriksi AAV6 -vektorille ITR -koettimilla saatiin 6.09 ± 3.94 x 109 TCID50 IU / mL (n = 5). Alkuperäiseen protokollaan tehtiin muutoksia, jotka paransivat menetelmän toistettavuutta ja tarkkuutta sekä voivat vähentää mahdollisuutta infektiivisyystitterin yliarviointiin. Analyysimenetelmää voidaan nykyisessä muodossaan käyttää tutkimuskäytössä AAV-vektorien kehitystyössä tai mahdollisesti myöhemmin siirtää ja optimoida AAV-geeniterapiavektoreita valmistavaan tuotantolaitokseen ja käyttää siellä tuotantonäytteiden tai valmiin lääketuotteen infektiivisyystitterin määrittämiseen.Adeno-Associated Viruses (AAVs) are quickly becoming one of the most applied vectors for gene therapy applications. In the recent years three new AAV-based gene therapies have been approved by U.S. Food and Drug Administration (FDA) and European Medicines Agency (EMA). The regulatory bodies require accurate and reliable characterisation of the clinical grade viral vectors during and after production. Analytic methods measuring the purity, potency and safety of the product support the up-stream and down-stream processes during the production and are used for final-drug substance characterisation. Median Tissue Culture Infectious Dose (TCID50) is a well-established method for measuring the infectious titer of a virus. Here, an assay for determining the infectious titer of AAVs, which has previously been used to characterise the existing AAV2 Reference Standard Material (AAV2RSM) was set up and optimised for research use at Kuopio Center for Gene and Cell Therapy (KCT). The assay utilizes the HeRC32-cell line, a HeLa clone, that stably expresses AAV Rep and Cap -proteins and in presence of adenovirus, enables the replication of recombinant AAV-vectors. The cells were grown in 96-well plates and infected with 10-fold dilution series of AAV vectors (AAV2 and AAV6) using human adenovirus type 5 as the co-infector. 72 hours post infection the vector genome replication of AAV was detected with quantitative PCR (qPCR). Thresholds for qPCR determined copy number and cycle threshold (Ct) were set and used for the determination of infection-positive wells. The 50-percent endpoint was observed and used to calculate the infectious titer according to the Spearman-Kärber method. The assay was set up and optimised with the AAV2 Reference standard material (AAV2RSM) using two different primer-probe sets (targeted sequences were; SV40 polyadenylation signal and AAV inverted terminal repeats (ITRs)). Plates infected with AAV2RSM were analysed separately with both primers resulting in mean infectious titers of 8.07 ± 3.13 x 108 TCID50 Infectious Units (IU) / mL (n = 9) and 1.27 ± 0.464 x 109 TCID50 IU/mL (n = 9) for SV40 and ITR, respectively. After the assay was set up with the AAV2RSM, an in-house AAV6 product was analysed with the ITR primers yielding 6.09 ± 3.94 x 109 TCID50 (IU) / mL (n = 5). The assay protocol was successfully set up for research use at the KCT laboratory. Improvements were added to the original protocol to increase assay robustness, accuracy and precision as well as to minimize the possibility of over-estimation of the infectious titer. The assay can be further optimised for a particular therapeutic AAV product in the research laboratory or technology transferred to a production facility for optimisation and validation for the analytics needs of a production pipeline