A levedura como sistema modelo no estudo de compostos químicos: caso de estudo da fibrose quística

Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A Fibrose Quística é uma doença autossómica recessiva causada por mutações que resultam na redução da atividade ou expressão da proteína cystic fibrosis transmembrane conductance regulator na superfície das células. Desde a última década tem-se constatado avanços significativos na terapêutica farmacológica desta doença multissistémica, particularmente na utilização de pequenas moléculas que atuam diretamente na proteína CFTR, fisiopatologicamente responsável pela doença. O mecanismo de ação destes fármacos é ainda discutido e não se encontra completamente descrito. Para além disso, a combinação de leveduras com os novos moduladores da Fibrose Quística não foi ainda documentada. Deste modo, esta investigação tem como principal objetivo avaliar o impacto dos fármacos tezacaftor (VX-661), ivacaftor (VX-770) e lumacaftor (VX-809) na levedura Saccharomyces cerevisiae, através da caracterização do citoesqueleto (actina-F e microtúbulos). O impacto destes fármacos foi testado numa estirpe selvagem (BY4742) e numa estirpe derivada isogénica. Relativamente à distribuição de microtúbulos, não foi identificado um efeito após exposição aos compostos, o que sugere a ausência de um impacto sobre o ciclo celular da levedura. Adicionalmente, constatámos um efeito na distribuição da actina-F nas células de uma colónia de estirpe selvagem expostas a VX-770 e VX-809, tendo-se observado despolarização de patches e cabos e uma redução do número de cabos no córtex celular. Estes resultados podem indicar uma resposta ao stress mediada pela actina-F, sendo necessárias experiências adicionais para testar esta hipótese. No que diz respeito ao efeito dos compostos sobre a estirpe isogénica, não foi possível obter resultados reprodutíveis devido ao pequeno número de colónias e à variabilidade de crescimento após a transformação.Cystic Fibrosis (CF) is an autosomal recessive caused by mutations that lead to reduced activity or expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein at the cell surface. Small-molecule drugs targeting directly the faulty protein developed within the last decade have led to remarkable progress in the treatment of this multisystemic disease. However, the precise mechanism by which these drugs act is yet to be fully understood. Moreover, there are no studies reporting on the combinations of yeasts with CF drugs. Thus, we aimed to investigate the impact of the CF drugs tezacaftor (VX-661), ivacaftor (VX-770) and lumacaftor (VX-809) in a yeast model of Saccharomyces cerevisiae. To do so, we have assessed the impact of the CF drugs on cytoskeleton (F-actin and microtubules) in two strains – wild type (BY4742) and an isogenic strain to wild type. We found no effect on microtubules distribution after VX drug exposure, which suggest that these have no impact on the yeast cell cycle. On the other hand, we found that VX-770 and VX-809 had an effect on the F-actin distribution in one wild type colony, having observed depolarization of both patches and cables and a reduction in the number of cables in the cellular cortex. These findings may indicate a stress response mediated by F-actin, yet additional investigations are warranted to test this hypothesis. We could not determine the effect of VX drugs on the isogenic strain, as non-reproducible results were observed due to growth variability between colonies and the small number of colonies obtained after transformation