Modelling strategies to assess the role of monocytes and macrophages in HIV/AIDS pathogenesis : optimisation of protocols for ex-vivo monocyte/macrophage phenotyping, isolation, and in-vitro differentiation

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2020Monócitos e macrófagos são células do sistema imune inato com papel conhecido não só na infeção aguda por VIH e subsequente estabelecimento de reservatórios virais, mas também na inflamação generalizada que determina a progressão da doença. As semelhanças entre VIH-1 e VIH-2, assim com diferenças descritas na interação entre vírus e células imunes inatas levou à hipótese de um distinto perfil de ativação e diferenciação contribuir para o melhor prognóstico associado à infeção por HIV-2. A compreensão do papel destas células na patogénese do VIH tem sido limitada pela sua reatividade à manipulação e complexidade da caracterização fenotípica. Consequentemente, com este trabalho pretendeu-se determinar o impacto do processamento no fenótipo e subsequente diferenciação monócito-macrófago, complementado por fenotipagem compreensiva por citometria de fluxo. Monócitos circulantes de doentes infetados por VIH-1 e VIH-2 foram adicionalmente avaliados para validação dos resultados. Apesar de maior pureza, este trabalho demonstrou que isolamento de PBMC por centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll seguido de Percoll resultou numa maior expressão de marcadores de ativação e apresentação antigénica, com concomitante menor expressão de PD-L1, associado a imunossupressão. De salientar, extensa fenotipagem identificou CD163 como marcador diferenciador entre macrófagos M1 e M2 assim como amplificação do fenótipo pró-inflamatório com positividade para CD16. Relativamente à infeção por VIH, alguns marcadores correlacionaram-se com tipo de vírus enquanto outros com gestão da doença. Resultados preliminares sugerem uma associação entre a expressão de CD163 e infeção por VIH-1. Menor expressão de HLA-DR em monócitos clássicos e sobre-expressão de SLAN em monócitos não-clássicos foi observada em piores condições clínicas, particularmente se VIH-2-positivo. Este trabalho sugere um fenótipo monócito/macrófago e perfil de ativação distinto, com implicações terapêuticas no potencial desenvolvimento de fármacos imunomodeladores. Futuros estudos baseados nestes protocolos serão usados para aprofundar o conhecimento da complexa relação entre HIV e o sistema monócito/macrófago.Monocytes and macrophages are innate immune cells known to contribute not only to acute HIV infection and reservoir establishment but also to the generalised inflammation that determines disease progression. The similarities between HIV-1 and HIV-2 and the reports of different interaction between each virus and innate immune cells prompted the hypothesis of a distinct monocyte/macrophage activation profile and differentiation contributing to the better prognosis and slow disease progression seen with HIV-2 infection. Understanding the contribution of these cells to HIV pathogenesis has been limited by their high reactivity to manipulation and complexities of phenotypic characterization. Consequently, we sought to determine the impact of experimental procedures in monocyte/macrophage phenotype and subsequent differentiation, complemented by comprehensive flow cytometric phenotyping. Furthermore, circulating monocytes from HIV-1 and HIV-2 infected individuals were evaluated for validation. Despite higher monocyte purity, the present study revealed that PBMC purification with Ficoll followed by Percoll density gradient centrifugation resulted in greater expression of molecules associated with activation and antigen presentation along with reduced PD-L1 expression, associated with immunosuppression. Noteworthy findings following comprehensive phenotyping include CD163 as a relevant differentiating marker between M1 and M2 macrophages as well as increased inflammatory phenotype and antigen presentation with CD16 positivity. Pertaining to HIV infection, some markers correlated with HIV-type whereas others with clinical disease control. Preliminary data suggest an association between CD163 expression and HIV-1 infection. Interestingly, lower HLA-DR expression in classical monocytes and greater SLAN expression in non-classical monocytes were seen with worse clinical conditions, particularly in HIV- 2 infected patients. Collectively, our data suggests a distinctive monocyte phenotype and activation profile in HIV- 1 compared to HIV-2 infection, with potential therapeutic implications for the development of immunomodulatory agents. Future data based on these optimised procedures will be used to further evaluate the complex relationship between HIV infection and the monocyte/macrophage system