In vivo optical imaging based characterization of siRNA/SSO therapeutics and transgenic mice

Nukleinsäuren und ihre dazugehörig synthetischen Oligonukleotid-Analoga, wie small interfering RNA (siRNA) und splice switching Oligonukleotide (SSO), drängen immer mehr in die Rolle der Hauptakteure der Forschung. Sie bilden eine Klasse von Kandidaten, welche das Potenzial besitzt eine Vielfalt von unterschiedlichen genetischen Erkrankungen zu therapieren. Deren große Bedeutung kommt zu tragen, da die am Markt zugelassenen „small molecule“ Substanzen nur eine limitierte Anzahl von zellulären Proteinen spezifisch beeinflussen können. Der Hauptteil dieser Diplomarbeit befasst sich mit Nukleinsäure-basierten Therapeutika, welche zur Entwicklung von personalisierter Gentherapeutika herangezogen werden können. Die Untersuchungen wurden mit Hilfe von Fluoreszenz-basiertem Imaging (FLI) und Biolumineszenz-basiertem Imaging (BLI) in vivo und ex vivo durchgeführt. Die siRNA ermöglicht die Suppression eines beliebigen Onkogens auf Basis ihrer Fähigkeit des „Gene-Silencings“. Dies erfolgt durch das komplementäre Paaren der siRNA an die gewünschte mRNA Abfolge der Target-Sequenz. Dennoch sind Modifikationen der synthetisch hergestellten siRNA limitiert, da sie in weiterer Folge noch kompatibel für die nachgeschalteten Enzyme bleiben muss, um einen Erfolg zu erzielen. Es ist jedoch bekannt, dass die Nieren und die Leber primäre Zielorgane der Biodistributionskette sind. Ein Teil der vorliegenden Diplomarbeit untersucht das Biodistributionsverhalten von systemisch applizierter siRNA, welche an ein Fluorophor, AF750, gekoppelt worden ist. Dies ermöglicht das „live“ Tracking des Moleküls mittels FLI in vivo. Die Ergebnisse der behandelten Gruppe zeigen Reproduzierbarkeit untereinander, da wiederholt klare Signale in Nieren und Blase beobachten wurden. Somit konnte die renale Exkretion der AF750 gekoppelten siRNA Moleküle gezeigt werden. Splice Switching Oligonukleotide (SSO), besitzen die Fähigkeit, abweichende Splicing-Seiten zu korrigieren und somit die Splicing-Maschinerie auf den richtigen Weg zu leiten um ein funktionales Protein aus der erhaltenen mRNA zu translatieren. Ein weiteres Projekt befasst sich in dieser Diplomarbeit mit der Lokalisation und Funktionalität von systemisch injizierten SSO. Die Ergebnisse einer erfolgreichen Splicing Korrektur und der damit gekoppelte Erhalt eines funktionalen Reportergenes, der Luciferase, wurde mittels BLI untersucht. Die erfolgreiche Splicing Korrektur resultiert in einer Erhöhung der Signalintensität im BLI. Obwohl mittels in vivo BLI keine ersichtliche Signalintensitäts-Zunahme und somit erfolgreiche Splice-Korrektur beobachten werden konnte, waren die Ergebnisse im ex vivo BLI erfolgreich. Letzteres konnte Signale in der Lunge und Blase der behandelten Gruppe nachweisen. Daraus lässt sich auf eine erfolgreiche Splice-Korrektur und somit die SSO Lokalisation in der Lunge und Blase schlussfolgern. Mit Hilfe der BLI Methode wurde in einem weiteren Project die Luciferase Reportergen-Aktivität in einem transgenen Maus-Model untersucht. Der verwendete transgene Stamm trägt das Reportergen Luciferase,welches unter Kontrolle des in Typ II Pneumocyten der Lunge aktivierten SpC-Promotor exprimiert wird. Die vorliegenden Ergebnisse wiesen eine Aktivität des Promoters sowohl in der Lunge als auch im Hautgewebe nach. Das letzte Projekt dieser Diplomarbeit befasst sich mit dem metastatischen Potenzial von B16F10 Melanom Zellen, einem Modell für aggressiven Melanom Zellen, welche in der Entwicklung von Chemotherapeutika gegen Hautkrebs verwendet werden. Darüber hinaus wurde die Rolle von Thy-1.2 in der Extravasation und folgendlich Metastase der systemisch applizierten B16F10 Zellen näher untersucht. Thy-1.2. ist ein Zelloberflächen-Protein, welches mit der Adhäsion der Melanom Zellen an aktivierte humane Endothelzellen assoziiert wird. In diesem Experiment wurden Transgene Thy-1.2 Mäuse verwendet, die das Luciferase-Reportergen an den Thy-1.2 Promotor gekoppelt hatten. Somit konnte nach Injektion der Melanom Zellen mittels BLI die Thy-1.2 Aktivität untersucht werden und so auf ein mögliches metastatisches Potenzial rückgeschlossen werden. Jedoch war das Ergebnis nicht eindeutig, da es unklar war ob die in vivo BLI Signale in Lunge zur Leber durch Metastasierung oder nur durch den Blutfluss beeinflusst wurde.Nucleic acids and their synthetic oligonucleotide analogs, such as small interfering RNA (siRNA) and splice switching oligonucleotides (SSO), are highly attractive and promising constituents for developing therapeutics for a vast range of treatments. This thesis focuses on nucleic acid-based therapeutics and their in vivo studies in transgenic and non-transgenic mice by fluorescence-based imaging (FLI) and bioluminescence imaging (BLI). The first part of this thesis examines the biodistribution behavior of intravenously applied siRNA labeled with the near infrared emitting dye AF750 (AF750- siRNA) by FLI. Renal excretion of AF750- siRNA was observed within the investigated time frame. The AF750-siRNA treated group revealed FLI signals in bladder and kidney area and also shows reproducibility among the group. These findings were validated by ex vivo organ imaging, as the same organs showed signals in the treated group. Splice switching oligonucleotides can correct aberrant splicing and redirect the splicing machinery resulting in transcription of the functional protein. The second project investigated systemically administered splice switching oligonucleotides (SSO) based polyplexes within transgenic reporter mice (Luc 705 Split-Luc mice), which carry an interrupted firefly luciferase reporter gene. The interruption is achieved via a mutated human beta-globin intron 2 which includes an aberrant splice site at nucleotide 705. The applied SSO should restore an aberrant splicing outcome resulting in luciferase expression trackable by BLI. Moreover, localizing successful SSO induced splice correction was aimed at. The Luc-SSO polyplex treated group did not demonstrate any clear results within in vivo whole-body imaging experiments. However, the findings obtained in ex vivo organ imaging revealed reproducible luciferase detection in lung and bladder area of animals treated with Luc-SSO based polyplexes in comparison to Non-coding-SSO based polyplexes. Third, reporter gene activity was measured by BLI in a lung-specific mouse model, which had the luciferase reporter gene coupled to the SpC-promoter, which is exclusively localized in alveolar type II cells of lungs. Lastly, another side project studied growth of implanted B16F10 melanoma cells in Tg Thy 1.2-Luc mice. Melanoma cell adhesion to activated human endothelial cells leading to migration and invasion into peripheral tissue is linked to Thy-1, a cell surface protein. Monitoring the role and interplay of Thy-1 in implanted B16F10 melanoma cells was part of this project. The investigation process was monitored by BLI, as the luciferase reporter gene was coupled to the Thy-1 promoter. Therefore, localization of growth and metastatic potential could be visualized, and the concerning organs linked to a signal movement were from lungs to liver