Développement d’un nouveau système de suivi des mutations chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Les mutations sont la source de la diversité génétique nécessaire au changement évolutif et sont le déclencheur de maladies complexes telles que le cancer. Il est essentiel de comprendre les processus mutationnels. Les mutations peuvent provenir d'un large éventail de mécanismes tels que des dommages à l'ADN mal réparés ou non réparés causés par des facteurs endogènes ou exogènes. La dérégulation de la transcription, la première étape de l'expression des gènes et les défauts de la réparation de l’ADN peuvent moduler le taux de mutation.Les expériences d'accumulation de mutations (MA) dans des organismes modèles tels que la levure sont indispensables pour étudier la mutagenèse. Cependant, ces expériences de MA classique sont longues et laborieuses. Dans ce projet, nous avons développé une nouvelle approche microfluidique pour suivre l’accumulation de mutations spontanées à l'échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ce système microfluidique automatisé permet de créer jusqu'à 150 rétrécissements de population et d’analyser par séquençage à haut débit (NGS) le spectre de mutations dans différents contextes génétiques. En parallèle de l'approche génomique, un système de gène rapporteur a été mis en place pour déterminer les spectres de mutations du gène CAN1 et a été utilisé dans les mutants de la transcription et de la réparation de l'ADN comme une première étape pour étudier l'impact de l'interaction entre la transcription et la réparation de l'ADN sur les processus de mutagenèse. Les outils expérimentaux développés dans ce travail offrent des perspectives importantes pour des mesures précises des profils mutationnels qui permettront de déchiffrer les mécanismes moléculaires à l'origine de maladies graves.Mutations are the source of genetic diversity necessary for evolutionary change and are the trigger of complex diseases such as cancer. It is therefore essential to understand mutational processes. Mutations may arise from a wide range of mechanisms such as incorrectly repaired or unrepaired DNA damages caused by endogenous or exogeneous factors. Deregulation of transcription, the first step of gene expression, and defects in DNA repair can modulate the mutational rate. Mutation accumulation (MA) experiments in model organisms such as budding yeast are indispensable to study mutagenesis. However, classical MA is time consuming and laborious. In this project, a new microfluidic-based approach was developed to monitor spontaneous mutation accumulation on the genomic scale in yeast Saccharomyces cerevisiae. This automated microfluidic system allows the growth of yeast populations over 150 bottlenecks and the analysis of the mutation spectrum in different genetic contexts by high-throughput sequencing (NGS). The microfluidic MA approach was validated in two different genetic backgrounds, a wild-type strain and a base-excision DNA repair mutant with a well-defined mutational profile. In parallel to the genomic approach, a reporter gene system was set up to determine the mutation spectra of the CAN1 gene and used in transcription and DNA repair mutants as a first step to investigate the impact of transcription/DNA repair interplay on mutational processes. Experimental tools developed in this work provide important perspectives for precise measurements of mutational profiles that will allow to decipher molecular mechanisms at the origin of severe diseases