Développement et caractérisation d'outils pour étudier le recyclage de l'actine

La polymérisation de l'actine fournit la force nécessaire à de nombreux processus vitaux de la cellule eucaryote. La réaction de polymérisation est alimentée par des monomères chargés d'ATP, qui sont progressivement hydrolysés dans les filaments d'actine. Les segments des filaments riches en ADP sont progressivement désassemblés. La dynamique rapide du cytosquelette d'actine nécessite également un recyclage des monomères de l'état ADP à l'état ATP. La compréhension sur le recyclage sont pauvres. Nous manquons de sondes adaptées pour suivre l’état du nucléotide lié à l'actine et de systèmes biomimétiques appropriés pour étudier le renouvellement. Pour contourner ces limitations, j'ai procédé dans deux directions différentes mais complémentaires.(1) J'ai identifié des nucléotides fluorescents qui se lie à l'actine avec des caractéristiques similaires à celles de l'ATP: les dérivés de N6-(6-Amino)hexyl-ATP. Ces sondes permettent de suivre l'assemblage de l'actine et l'échange de nucléotides par microscopie et par anisotropie de fluorescence. Les interactions avec les protéines de liaison à l’actine restent fonctionnelles. Ces outils devraient permettre de déterminer les conditions dans lesquelles l'actine est recyclée.(2) J'ai conçu un système confiné: des émulsions d’eau dans l'huile avec des protéines purifiées. J’ai pu reconstituer la formation de cortex d'actine statiques, mais le système peut être implémenté avec des protéines de liaison à l'actine impliquées dans le recyclage.Les deux systèmes devraient être utilisés à l'avenir en synergie afin de déterminer les conditions biochimiques nécessaires pour maintenir un cytosquelette d’actine dynamique.Actin polymerization provides the necessary force for many vital processes in the eukaryotic cell. The polymerization reaction is powered by ATP-charged monomers, which are gradually hydrolyzed within the actin filaments. Segments of the ADP-rich filaments are gradually disassembled. The rapid dynamics of the actin cytoskeleton also requires a recycling of the monomers from the ADP state to the ATP state.Understanding of recycling is poor. We lack suitable probes to monitor the state of the actin-bound nucleotide and appropriate biomimetic systems to study turnover. To circumvent these limitations, I have proceeded in two different but complementary directions.(1) I have identified fluorescent actin-binding nucleotides with characteristics similar to those of ATP: N6-(6-Amino)hexyl-ATP derivatives. These probes allow to follow actin assembly and nucleotide exchange by microscopy and fluorescence anisotropy. Interactions with actin-binding proteins remain functional. These tools should make it possible to determine the conditions under which actin is recycled.(2) I have designed a confined system: water-in-oil emulsions with purified proteins. I was able to reconstruct the formation of static actin cortex, but the system can be implemented with actin-binding proteins involved in recycling.The two systems should be used synergistically in the future to determine the biochemical conditions necessary to maintain a dynamic actin cytoskeleton