Functional characterization of spliceogenic variations causing splicing defects in cancer-predisposition genes : implications in medical genetics

Aujourd’hui, le défi majeur en génétique médicale est l’interprétation clinique des variations détectées dans le génome des patients. Dans un contexte de maladie monogénique, l’identification de la variation pathogène permet d’optimiser la prise en charge des patients et de leurs apparentés. Les variations non-sens ainsi que celles localisées au niveau des sites canoniques d’épissage (IVS±1/2) sont généralement considérées causales. Toutefois, il est possible que certaines d’entre elles induisent des anomalies d’épissage en phase permettant potentiellement la production d’une protéine fonctionnelle. Afin de tester cette hypothèse, nous avons choisi comme modèles d’étude deux gènes majeurs de prédisposition aux cancers : BRCA2, pour le syndrome sein-ovaire et MSH2, pour le syndrome de Lynch. Des approches expérimentales complémentaires ont été mises à profit afin de caractériser l’impact de ce type de variations non seulement au niveau de l’épissage mais également au niveau de la protéine. Notre étude portant sur des variations de BRCA2 a démontré que certaines variations IVS±1/2 et non-sens (i) induisent un saut en phase de l’exon 12 du fait de l’altération de sites d’épissage ou d’éléments de régulation et (ii) sont de ce fait responsables du maintien de l’activité BRCA2, tout en étant hypomorphes. Ces travaux montrent, pour la première fois dans un gène de prédisposition au cancer, que certaines variations présumées nulles peuvent contourner la perte totale de fonction du fait de leur impact sur l’épissage. Nos données remettent ainsi en question le caractère pathogène de ces variations. Dans le cadre de notre étude portant sur des variations IVS±1/2 de MSH2, nous avons caractérisé trois biotypes d’anomalies d’épissage en phase : (i) des sauts d’exon, (ii) des délétions de portions exoniques et (iii) des rétentions introniques, avec pour conséquence au niveau protéique des délétions ou insertions de plus ou moins grande taille dans différents domaines fonctionnels. Toutes les isoformes protéiques MSH2 résultant de ces variations splicéogéniques se sont avérées inactives, confirmant ainsi leur caractère pathogène. L’ensemble de ces travaux souligne l’importance d’exercer une certaine prudence dans l’interprétation des variations considérées a priori pathogènes mais susceptibles de générer des anomalies d’épissage en phase. Dans ce contexte, la combinaison d’approches expérimentales complémentaires pour appréhender l’impact biologique au niveau de l’ARN et de la protéine est essentielle pour une interprétation fiable de ce type de variations. Ces données mettent également en exergue la problématique de l’interprétation clinique des variations hypomorphes dans les gènes de prédisposition aux cancers.Today, the major challenge in medical genetics is the clinical interpretation of nucleotide variants detected in a patient’s genome. In the context of a monogenic disease, the identification of the pathogenic variant allows the optimization of the medical care of patients and their relatives. Nonsense variations as well as those located at the canonical splice sites (IVS±1/2) are generally considered pathogenic. However, it is possible that a fraction of them induce in-frame splicing anomalies that can potentially result in the production of a functional protein. To test this hypothesis, we used as model systems two major cancer-predisposition genes: BRCA2, implicated in hereditary breast and ovarian cancer syndrome and MSH2, involved in Lynch syndrome. We took advantage of complementary experimental approaches to characterize the impact of this type of variants not only in RNA splicing but also at the protein level. Our study on BRCA2 demonstrated that a subset of IVS±1/2 and nonsense variants (i) induce in-frame skipping of exon 12 via the modification of splice sites or of splicing regulatory elements and (ii) are able to maintain BRCA2 activity though being hypomorphic. These data provide the first evidence, in a cancer-predisposition gene, that certain presumed null variants can bypass total loss of function due to their impact on splicing. Thus our findings call into question the pathogenic nature of these variants. In our study on MSH2 IVS±1/2 variants, we characterized three biotypes of in-frame splicing defects responsible for deletions or insertions at the protein level in different MSH2 functional domains: (i) exon skipping, (ii) deletions of exonic portions and (iii) intron retentions. All the MSH2 protein isoforms resulting from these spliceogenic variants were found to be inactive, thus confirming their pathogenic classification. Altogether, our findings highlight the need to exercise caution in the interpretation of putative pathogenic variants susceptible to induce in-frame splicing modifications. In this context, the combination of complementary experimental approaches assessing the biological impact at the RNA and protein level is essential for a reliable interpretation of this type of variants. Furthermore, our results stress the problem of the clinical interpretation of hypomorphic variants in cancer-predisposition genes