Caracterização do modo de ação e do sinergismo entre duas celulases (famílias GH9 e GH48) de Bacillus licheniformis

Orientador: Prof. Dr. Luiz Pereira RamosDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Bioenergia. Defesa : Palotina, 24/02/2017Inclui referências: p. 63-70Resumo: A celulose é o polímero natural mais abundante do planeta e a hidrólise enzimática deste material apresenta grande potencial para a produção de combustíveis e insumos químicos de forma sustentável e renovável. Todavia, o custo dos complexos enzimáticos comerciais aplicados e os elevados tempos reacionais que este sistema exige ainda correspondem aos principais gargalos desse processo. Neste cenário, esforços ainda têm sido desprendidos na busca de enzimas potencialmente degradadoras da celulose até então não identificadas e nos estudos de seus respectivos modos de ação. Sendo assim, o presente trabalho objetivou a caracterização dos perfis hidrolíticos de duas celulases das Famílias GH9 e GH48 expressas por Bacillus licheniformis (BlCel9A e BlCel48A, respectivamente) quanto aos seus perfis de liberação de açúcares redutores solúveis (ARSol) e insolúveis (ARInsol) durante a hidrólise de celulose inchada com ácido fosfórico (PASC) e celulose bacteriana produzida por Acetobacter xylinum. Inicialmente, os substratos celulósicos foram caracterizados de modo que os perfis hidrolíticos pudessem ser correlacionados com suas características estruturais. Dois modelos de celulose foram obtidos. Enquanto a PASC apresentou baixo grau de polimerização (237 resíduos de anidroglucose) e ausência de fases cristalinas, um alto índice de cristalinidade (64,5%) e elevado grau de polimerização (2.259 resíduos de anidroglucose) foi observado para a celulose bacteriana. Em ambos os substratos, a BlCel48A apresentou-se como uma exoglucanase típica, liberando majoritariamente ARSol ao passo que BlCel9A apresentou tanto liberação de ARSol quanto de ARInsol, comprovando sua atividade endoglucanásica processiva. A diferenças estruturais entre os substratos empregados permitiram a obtenção de diferentes perfis hidrolíticos para BlCel9A. Quando aplicada sobre PASC, uma maior liberação de ARSol foi observada, mesmo em baixas cargas enzimáticas, pois o substrato já apresenta em maior quantidade terminais de cadeia disponíveis para a sua ação processiva. Por outro lado, quando empregada sobre celulose bacteriana, a BlCel9A demonstrou uma maior produção de ARInsol em baixas cargas enzimáticas e em tempos reacionais de até 6 horas. Além disto, quando avaliada a hidrólise de celulose bacteriana ao longo do tempo empregando 0,25 ?mol L-1 dessa celulase, foi observada uma liberação inicial equimolar de ARInsol e ARSol, ao passo que a proporção de ARSol aumentou ao longo do tempo. A ocorrência de um efeito sinérgico entre as enzimas foi evidenciada apenas em celulose bacteriana devido à disponibilidade limitada de terminais de cadeia para a ação exoglucanásica de BlCel48A e ao impedimento estrutural causado pela alta cristalinidade desse substrato. Nesse caso, a liberação de açúcares solúveis pela mistura de BlCel9A e BlCel48A chegou a se apresentar sete vezes maior do que a soma das atuações individuais de cada enzima neste substrato. Palavras-chave: Bacillus licheniformis, celulases, sinergismo, hidrólise enzimática.Abstract: Cellulose is the most abundant biopolymer on earth and the hydrolysis of this material presents great potential for the sustainable and renewable production of fuels and chemicals. However, the high cost of the commercial enzymatic complexes used for this purpose and the high reaction times are still the main technological barriers of this process. In this way, the scientific community still searching for new potential enzymes able of hydrolyzing cellulose and the hydrolytic characterization of these enzymes is essential for these studies. In this scenario, the goal of this work was to characterize the hydrolytic profiles of two Bacillus licheniformis cellulases of Family GH9 and Family GH48 (BlCel9A and BlCel48A, respectively) in relation to their capacity of release soluble (ARSol) and insoluble (ARInsol) reducing sugars during hydrolysis of phosphoric acid swollen cellulose (PASC) and bacterial cellulose (produced by Acetobacter xylinum). At first, the cellulosic substrates were characterized in order to enable a better correlation of their structural features with the hydrolytic profiles. Two distinct cellulosic structures were obtained. PASC presented low degree of polymerization (237 anhydroglucose residues) and no crystalline phases. By contrast, a high crystallinity index (64.5%) and a high degree of polymerization (2,259 anhydroglucose residues) were observed for bacterial cellulose. In both substrates, BlCel48A presented as a typical exoglucanase, releasing mostly ARSol. On the other hand, BlCel9A presented both release of ARSol and ARInsol, confirming its processive endoglucanase activity. The difference of the substrates structures results in different hydrolytic profiles for BlCel9A. When PASC was used as substrate (low degree of polymerization) there are already a lot of chain ends available for a processive action, and in these cases a higher release of ARSol was observed, even at low enzymatic loadings. By contrast, when used bacterial cellulose as substrate (high degree of polymerization), BlCel9A showed a higher production of ARInsol at low enzymatic loads and in the first 6 hours of reaction. Moreover, when studied the time course hydrolysis of 0.25 ?mol L-1 of BlCel9A against bacterial cellulose, an initial equimolar release of ARInsol and ARSol was observed, while the ratio of ARSol increased over time. A synergistic effect was observed only on bacterial cellulose due to the crystalline structural impediments and the limited availability of chain ends for the exoglucanase action of BlCel48A. The release of soluble sugars by the BlCel9A and BlCel48A mixture was 7-fold higher than the sum of the individual sugars released by the individual action of each enzyme in this substrate. Keywords: Bacillus licheniformis, cellulases, synergism, enzymatic hydrolysi