Theoretical development of naked mRNA vaccines and their delivery in combination with electroporation

The mRNA-based vaccine manufacturing process begins with the generation of a DNA template either through linearization of a plasmid with a restriction enzyme or through PCR amplification. The template should contain an RNA polymerase promoter, such as T7 or SP6, and the corresponding sequence for the mRNA construct. In vitro transcription ensues and the template is subsequently degraded by a DNase step. The addition of the 5' cap and the 3' poly(A) tail can be achieved during IVT or enzymatically after transcription. The next step is purification, which can be accomplished by high- pressure liquid chromatography or fast protein liquid chromatography, for example. Modulation of the synthetic mRNA's immunogenicity should be kept in mind. After sterility, identification, purity, and potency checking, the result is formulated into a pharmaceutical product and released. Provided that the reaction materials and vessels are the same, these processes allow Good Manufacturing Practice facilities to change to a new vaccine in a short amount of time. Upon release into the cytoplasm of a cell (via the chosen delivery mechanism and administration route), the mRNA construct will use the host cell's translational machinery to produce an adequate amount of the encoded immunogen that is presented adequately to the immune system. In this thesis I suggest a hypothetical experimental setup for the development of a naked mRNA vaccine with electroporation as a delivery strategy.Informacinės RNR (iRNR) pagrindu kuriamų vakcinų gamybos procesas prasideda pagaminant DNR šabloną, linearizuojant plazmidę restrikcijos fermentais arba amplifikuojant DNR fragmentą PGR metodu. Šablone turi būti RNR polimerazės promotorius, pvz., T7 arba SP6, ir atitinkama iRNR konstrukcijos seka. Vyksta transkripcija in vitro, o šablonas vėliau suskaidomas DNazės. 5' kepurės ir 3' poli (A) uodegos pridėjimas gali būti atliekamas in vitro transkripcijos metu arba fermentiškai po transkripcijos. Kitas žingsnis yra gryninimas, kurį galima atlikti, pavyzdžiui, naudojant aukšto slėgio skysčių chromatografiją. Reikėtų nepamiršti sintetinės iRNR imunogeniškumo mažinimo etapų. Patikrinus iRNR sterilumą, grynumą ir efektyvumą, gaminamas farmacijos produktas. Jei reakcijos medžiagos ir kitos priemonės yra vienodos, tai leidžia Geros gamybos praktikos priemonėms per trumpą laiką pagaminti naują vakciną. Pernešus iRNR į ląsteles (pasirinktu pernešimo metodu), sukonstruota iRNR išnaudoja ląstelės transliacinę aparatą, kad pagamintų pakankamą kiekį užkoduoto imunogeno, kuris pateikiamas imuninei sistemai. Šiame darbe siūloma hipotetinė eksperimentinė metodiką, kaip sukurti „nuogos“ iRNR pagrindu gaminamą vakciną, kurios pristatymo strategija būtų elektroporacija.Gamtos mokslų fakultetasBiologijos katedr