Identificação de um potencial biomarcador de malária

A malária é uma doença que afeta a população mundial há muitos anos, sendo estudada pela primeira vez em 1880. Esta doença é provocada por parasitas protozoários do género Plasmodium spp., dividindo-se em cinco espécies. Das cinco espécies destaca-se a espécie P. falciparum, à qual está associada a maior taxa de mortalidade. Os métodos de diagnóstico desta doença podem dividir-se em diretos e indiretos, no entanto os métodos diretos são os mais utilizados em campo. Um exemplo é o teste de diagnóstico rápido que permite a deteção de antigénios do parasita, com elevada sensibilidade e especificidade. Os biomarcadores possíveis de detetar neste tipo de testes apresentam algumas desvantagens, como não estarem presentes em determinadas estirpes de P. falciparum ou não serem utilizados em cargas parasitárias baixas, sendo necessária a pesquisa de novos biomarcadores para a produção de novos tipos de testes de diagnóstico rápido. O objetivo principal deste trabalho é a deteção de novos biomarcadores de malária, recorrendo a uma abordagem de proteómica. Foram analisadas amostras de um indivíduo infetado com P. falciparum, de um indivíduo saudável com historial clínico de malária e de um indivíduo saudável sem historial clínico de malária, bem como culturas de eritrócitos humanos infetadas com P. falciparum. O trabalho desenvolvido dividiu-se nas seguintes etapas sequenciais: depleção das proteínas mais abundantes para análise do perfil proteico de amostras de sangue, soro e plasma, e de culturas de eritrócitos humanos infetadas por P. falciparum; análise proteómica; excisão de spots de interesse para futura identificação de proteínas; análise das amostras de plasma por Nano LC-MS/MS e identificação das proteínas com alteração de expressão como potenciais biomarcadores de infeção por P. falciparum. No final deste trabalho foi possível identificar, por Nano LC-MS/MS, 14 proteínas que apresentavam alterações significativas na sua expressão. Estas 14 proteínas, todas de origem Homo sapiens, eram indicativas do combate da infeção por parte do hospedeiro, podendo ser consideradas possíveis biomarcadores. Foram igualmente identificados e excisados spots dos géis provenientes da eletroforese bidimensional, que poderão corresponder a proteínas de interesse. No entanto, não foram identificadas proteínas de origem P. falciparum, uma vez que estas proteínas podem encontrar-se em menor quantidade, não sendo detetadas nas técnicas utilizadas. Neste trabalho foram otimizados protocolos que permitem, futuramente, a análise de amostras de plasma através de técnicas de proteómica, nomeadamente a partir da eletroforese bidimensional.Malaria is a disease that has affected the world's population for many years, being studied for the first time in 1880. This disease is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium spp., dividing into five species. From the five species, the specie P. falciparum stands out, which is associated a higher mortality rate. The methods of diagnosis of this disease can be divided into direct and indirect, however direct methods are the most used. An example is the rapid diagnostic test that allows the detection of parasite antigens, with high sensitivity and specificity. The biomarkers that can be detected in this type of tests have some disadvantages, requiring the search of new biomarkers to produce new types of rapid diagnostic tests. The main objective of this work is the detection of new malaria biomarkers, using a proteomics approach. Samples from an individual infected with P. falciparum, a healthy individual with a clinical history of malaria and a healthy individual without a clinical history of malaria were analyzed, as well as cultures of human erythrocytes infected with P. falciparum. The work developed was divided into the following sequential steps: depletion of the most abundant proteins for analysis of the protein profile of blood, serum and plasma samples, and of cultures of human erythrocytes infected with P. falciparum; proteomic analysis; excision of spots of interest for futures protein identification; analysis of plasma samples by Nano LC-MS/MS and identification of proteins with altered expression as potential biomarkers of infection by P. falciparum, At the end of this work, it was possible to identify, by Nano LC-MS/MS, 14 proteins that showed significant changes in their expression. These 14 proteins, all from Homo sapiens, were indicative of the host's fight against infection. Gels spots from two-dimensional electrophoresis were also identified and excised, which may correspond to proteins of interest. However, proteins of P. falciparum origin have not been identified, since these proteins can be found in lesser amounts, not being detected in the techniques used. In this work, protocols were optimized that allow, in the future, the analysis of plasma samples through proteomics techniques, namely from two-dimensional electrophoresis