Evaluacion de la expresion de proteínas en las celulas del cumulo como marcadores de la capacidad de desarrollo del oocito bovino

Para mejorar las tasas de producción in vitro de embriones (PIVE) bovinos es necesario entender los mecanismos moleculares que permiten la adquisición de la competencia oocitaria. Métodos de biología molecular parecen permitir conocer estos mecanismos. Adicionalmente los oocitos han sido seleccionados para la PIVE según su apariencia morfológica lo cual es subjetivo. El presente trabajo fue realizado para estudiar el efecto de la morfología de los complejos cúmulo-oocito (CCO) Bos indicus en el subsecuente desarrollo de los embriones in vitro y para determinar la expresión proteica de las células el cúmulo (CC) antes y después de la maduración in vitro. Ovarios de hembras B. indicus fueron colectados de un centro de faenado y transportados al laboratorio en solución salina a 30°C. Folículos entre 3-8 mm fueron aspirados manualmente y CCO clasificados como tipo I (TI): ooplasma homogéneo y ≥ 4 capas de CC compactas y tipo II (TII): ooplasma granular y ≥ 4 capas de CC con expansión en las células periférica. CC de 50 CCO fueron colectadas por medio de pipeteo manual y congelados en bicarbonato de amonio y liofilizados para posterior análisis de expresión de proteínas. Otro grupo de CCO fue madurado in vitro en TCM 199 suplementado por 24 h. Después de la maduración in vitro CC de 50 CCO fueron colectadas y procesadas de la misma manera como fue descrito anteriormente. Los CCO restantes fueron fertilizados in vitro con un toro de fertilidad conocida y los presuntos cigotos fueron cultivados in vitro dúrate 7 días. Diez blastocistos fueron teñidos con Hoechst 33342 y el número de blastomeras determinado para conocer la calidad embrionaria entre los grupos. La expresión de proteínas fueron determinadas para los siguientes grupos: CC inmaduras tipo I (TIT0) y tipo II (TIIT0); CC maduradas in vitro tipo I (TIT24) y tipo II (TIIT24). Para la extracción de las proteínas las células fueron sonicadas por 30 min. a 4°C, congeladas en nitrógeno líquido 3 veces y maceradas entre cada congelación. Veinte µg de proteína total para cada grupo fueron puestos en gel de SDS-PAGE y las proteínas fueron identificadas usando ESI-MS/MS. Diferencias en clivaje, tasa de embriones y número de blastomeras fue determinado usando la prueba t. Para determinar la diferencia en la expresión de proteínas se calculó un promedio para cada proteína utilizando los 5 picos más intensos de los péptidos identificados en la espectrometría de masa. La diferencia entre la densidad óptica de las bandas y la expresión de proteínas fue determinada utilizando una prueba GLM y la prueba Bonferroni como prueba post hoc (p0.05). La tasa de clivaje y de blastocistos para los tipos de CCO fueron de 88±4 y 89±8% y 36±7 y 33±8% respectivamente (TI n=220- TII n=161). El número de blastomeres fue 101 y 104 para TI y TII respectivamente. Las proteínas mayormente expresadas en las CC fueron alfa enolasa, beta-actina, estradiol 17-beta-dehidrogenasa 1, glutation S-transferasa, gliceraldehide 3-fosfatasa deshidrogenasa, proteína de choque térmico beta-1, histona H2B tipo 1-N, histona H4, mitocondria malate dehidrogenasa 2, proteina disulfito isomarasa A6, triosefospfato isomerasa, tubulin alfa-1C, vimentina. Las proteinas beta-actina y vimentina estuvieron mayormente expresadas en CC antes de maduración in vitro. En conclusión, no se encontró diferencias en la capacidad de desarrollo de CCO B. indicus con signos de expansión temprana indicando que ambos tipos podrían ser seleccionados para la PIVE. Las proteínas beta-actina y vimentina parecen ser importantes en el proceso de maduración de los CCO bovinos y posiblemente en la adquisición de la competenciaAbstract: In order to improve bovine in vitro fertilization success rates, there is a need to understand the molecular mechanisms that allow the oocyte to acquire developmental competence. Methods of molecular biology seem to give insight into these mechanisms. Additionally, oocyte selection is based on the evaluation of the cumulus-oocyte complex (COC) morphology, which has shown to be subjective. The present study was conducted to evaluate the effect of COC morphology on subsequent in vitro embryo development and to assess protein expression of cumulus cells (CC) of type I and type II COC before and after in vitro maturation. Bos indicus ovaries were obtained at an abattoir and COC aspirated from 3-8 mm follicles. COCs were defined as: type I (TI): homogeneous ooplasma and ≥ 4 layers of compact CC; type II (TII): granular ooplasma and ≥ 4 layers of slight expanded CC. CC from 50 COC were obtained and frozen in ammonium bicarbonate and immediately lyophilized for protein expression analysis. Other selected COCs were matured in vitro in TCM199 supplemented media for 24 h. After maturation, CCs from another 50 COCs were collected (T24) and processed as described above. The remaining COCs were fertilized with sperm from a fertile bull and presumptive zygotes cultured in vitro until day 7. Ten blastocysts per group were stained (Hoechst 33342) and blastomeres counted for assessment of embryo quality. CC proteins were obtained from the following groups: immature type I (TIT0) and type II (TIIT0); in vitro matured type I (TIT24) and type II (TIIT24). For protein extraction, we used sonication (30 min., 4°C), freezing and unfreezing in liquid nitrogen and maceration. Twenty µg of proteins were subjected to SDS-PAGE and identified by ESI-MS/MS. Differences in cleavage, embryo rates and blastomere numbers were analyzed by t test. Difference in optical intensity between bands and protein expression was assessed by GLM method and Bonferroni test as post hoc test. For protein expression, the mean of the 5 most intense peptides for each identified protein were calculated and compared between groups (p0.05). There were no differences in cleavage (88±4 vs 89±8%) and embryo rates (36±7 vs 33±8%) between COCs of TI (n=220) and TII (n=161), respectively. Blastomeres were also similar in TI (101) and TII (104) groups. Major proteins expressed in all CCs were alpha enolase, beta-actin, estradiol 17-beta-dehydrogenase 1, glutathione S-transferase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, heat shock protein beta-1, histone H2B type 1-N, histone H4, mitochondrial malate dehydrogenase 2, protein disulfide isomarase A6, triosephosphate isomerase, tubulin alpha-1C chain, vimentin. Beta-actin and vimentin were more expressed in CC of type I COCs before maturation (T0) (˃0.05). In conclusion, there are no difference in embryo development when using compact and early-expanded COCs indicating that both types can be selected for IVP. Proteins beta-actin and vimentin are structural proteins important for CC and oocyte communication and seem to be more expressed before maturation; when transzonal projections are still in placed allowing molecular interchange between both types of cells.Doctorad