Búsqueda de compuestos bioactivos a partir de bacterias del Phylumfirmicutes aisladas del octocoral pseudopterogorgia elisabethae recolectado en la Isla de Providencia

En este trabajo se emplearon 15 cepas bacterianas del Phylum Firmicutes con el fin de seleccionar una cepa ellas como productora de compuestos con actividad IQS. Para esto se llevó a cabo su cultivo en 4 medios diferentes (LBS, TAK, BM y MM), y luego se obtuvieron sus extractos mediantes el uso de la resina no iónica Diaion® HP-20, estos extractos fueron evaluados en el ensayo de actividad IQS frente al biosensor Chromobacterium violaceum ATCC 31532 (se evaluaron 64 extractos a 2.0, 1.0 y 0.2 mg/sensidisco haciendo los experimentos por duplicado). Los resultados de actividad IQS obtenidos permitieron seleccionar a las cepas Jeotgalicoccus halophilus, Bacillus licheniformis, Staphylococcus warneri, Ocenobacillus profundis, Bacillus anthracis y Bacillus horneckiae para continuar con el trabajo por tener extractos bioactivos. Luego, cada uno de los extractos bioactivos fue fraccionado por medio de CC en fase reversa obteniendo 3 fracciones (MeOH:H2O 1:9, MeOH:H2O 1:1 y MeOH), las cuales fueron evaluadas en el ensayo de actividad IQS, de esta manera se pudo establecer que la actividad IQS en todos los casos se presenta en las fracción metanólica, lo que muestra un carácter desde poco hasta medianamente polar de los compuestos responsables de la actividad IQS. En esta segunda etapa se seleccionaron las cepas J. halophilus y O. profundis para continuar con el estudio, por proporcionar las fracciones metanólica más activas y por no existir reportes de su química en la literatura. A continuación las bacterias seleccionadas J. halophilus y O. profundis fueron cultivadas en los medios LBS, TAK y BM, y sus medios agotados (100 mL x 10) fueron extraídos con DCM mediante una metodología L-L contínua lo que permitió obtener el extracto orgánico; así mismo, la fase acuosa resultante fue extraída por medio de resina Diaion® HP-20 obteniendo el extracto HP-20 residual por elución con metanol. Cada uno de estos dos extractos fue evaluado en el ensayo IQS encontrando que el extracto con mayor actividad correspondió al extracto orgánico obtenido del cultivo de J. halophilus en el medio LBS, por lo que esta cepa fue la selecionada para escalar su cultivo y obtener los compuestos bioactivos en cantidad suficiente para su identificación. En el paso siguiente se estudió cómo algunas variables en las condiciones de cultivo (volumen, agitación y tiempo de incubación) de J. halophilus en LBS, influyen en la cantidad y calidad del extracto obtenido (actividad IQS y complejidad). Encontrando que cuando se emplea agitación a 100 rpm, temperatura ambiente (~ 19 °C), durante un tiempo entre 96-144 h y haciendo cultivos de 100 mL en fiolas de 500 mL se logra obtener una buena cantidad de extracto activo. El proceso se repitió hasta obtener una masa de extracto suficiente (273 cultivos). Así mismo se estableció que el mejor método de extracción es el uso DCM en una extracción continua L-L. Una vez obtenido el extracto biactivo, se buscó establecer la influencia de la fase estacionaría en la separación de este extracto (RP-18, sílica y diol) y se pudo determinar que se obtienen los mejores resultados con resinas diol. Así, el fraccionamiento de todo el extracto se hizo por CC flash diol y se llevó a cabo de manera bioguiada, encontrando que la mayor actividad residía en las fracciones F2-F6. Estas fracciones fueron sometidas a cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía en columna (sílica gel) y cromatografía en placa delgada preparativa, obteniendo los siguientes compuestos con actividad IQS (en paréntesis se da la mínima concentración en la que detectamos actividad IQS): 4-(metiltio)fenol [1] (0.36 M), p-hidroxibenzaldehído [2] (0.41 M), 3-indolaldehído [3] (0.68 M), (1H-indol-3-il)oxoacetamida [4] (1.06 M), y 2-metilpropanoamida [5] (1.14 M). Todos los compuestos fueron determinados inequívocamente mediante el estudio de sus espectros de RMN y masas en modo IE, siendo los compuestos 3-4 los mayoritarios. Los compuestos 1 y 4 se reportan por primera vez para bacterias. Finalmente, fue estudiado el efecto del medio de cultivo en la producción de los compuestos bioactivos antes identificados 1-5. Para esto J. halophilus se cultivó en MOLP, KAL y LBS, con y sin adición de agar (0.3 g /L), encontrando que en el medio MOLP no hay evidencia de la producción de los compuestos indólicos 3-4, y no parece que se indujera la producción de ningún compuesto a juzgar por los análisis de CLAE y RMN, en las condiciones de cultivo probadas. Mientras, en los cultivos en LBS y KAL sí hay producción de derivados indólicos, y sorprendentmente la adición de agar en el medio LBS estimula la producción del ácido tiobenzoico [6], que nunca había sido reportado como metabolito para una bacteria. Con este estudio se contribuyó por primera vez en Colombia al desarrollo de una metodología automatizable para la selección de microorganismos capaces de producir compuestos con actividad IQS, a partir de aislamientos nativos de bacterias marinas. Lo anterior ha ayudado a abrir este campo del conocimiento en los productos naturales, del que se esperan los mayores desarrollos hacia el futuro, tanto a nivel mundial como local, y del que apenas se dan los primeros pasos en Colombia.Abstract. Fifteen bacterial strains belonged to the Phylum Firmicutes were used to develop a quorum sensing Inhibitors (QSI) screening. Each bacterium were cultured in four different media (LBS, TAK, BM y MM) and then, the compounds produced were extracted using the non-polar resin Diaion® HP-20. All the extracts (60 bacterial extracts and 4 control media) were tested using a QSI assay, against Chromobacterium violaceum ATCC 31532, at three different concentrations (2.0, 1.0 and 0.2 mg/disc) by duplicated. The culture extracts of Jeotgalicoccus halophilus, Bacillus licheniformis, Staphylococcus warneri, Ocenobacillus profundis, Bacillus anthracis and Bacillus horneckiae were selected as the most active in this preliminary screening. Subsequently each one of the extracts selected were fractionated by reverse phase column chromatography, obtaining three fractions (MeOH:H2O 1:9, MeOH:H2O 1:1 and MeOH). Each fractions were tested in the bioassay, showing in all the cases that the MeOH fraction was the most active one. Considering, the activity, the extracts yield, complexity by HPLC, the bacterial strains J. halophilus and O. profundis were selected to continue the study. Likewise, there are no reports about their chemistry. J. halophilus and O. profundis were cultured (100 mL x10) in LBS, TAK and BM culture media and the culture supernatants were extracted using a continuous liquid-liquid extraction with dichloromethane (organic extract). The remained aqueous phases were further extracted using the non-polar resin Diaion® HP-20 and named as HP-20 residual extracts. Each extract (organic and HP-20) were evaluated in the QSI assay. The results showed that DCM extract of culture of J. halophilus in LBS media was the most active. In order to know if there are changes in the yield and composition (QSI activity and complexity) of the extract of J. halophilus in LBS broth, other culture parameters as volume, shake and time were studied. Thus, J. halophilus were culture in LBS using three different volumes (100, 500 and 1000 mL), at 0 and 100 rpm, and cultured during 96 h and 144 h. Finally, the culture of J. halophilus was scaled up (100 mL X 273) at 100 rpm and 19 °C. Additionally, it was established the continous L-L extraction with DCM, as the best method for obtaining a clean extract. Subsequently, the influence of the stationary phase in the separation of the extract was studied using different phases. The best results were obtained using Diol flash CC. The bioguided fractionation demonstrated that the fractions F2 to F6 were the most active fractions. These fractions were purified by size exclusion chromatography, column chromatography and preparative thin layer chromatography yield the QSI compounds: 4- (methylthio)phenol 1 (0.36 M), p-hydroxibenzaldehide 2 (0.41 M), 3-indolaldehide 3 (0.68 M), (1H-indol-3-yl)oxoacetamide 4 (1.06 M) y 2-methylpropanoamide 5 (1.14 M), and the thiobenzoic acid 6 (activity was not determined). All of these compounds were unequivocally identified by NMR and MS-EI. The major components produced by J. halophilus were 3 and 4. The compound 1, 4 and 6 are reported by first time from bacterial source. Finally, the effect of the culture media over the production of the identified bioactive compounds was made. J. halophilus was cultured in MOLP, KAL and LBS with and without agar addition (0.3 g/L), finding that was not production of indolic compounds (3-4) or different kind of compounds, using MOLP media, judging by its HPLC-PDA and NMR analysis. While, indolic compounds were produced in KAL and LBS media, also the agar addition stimulates the production of thiobenzoic acid 6. This is the first chemical study reported for the bacterium J. halophilus and also in Colombia, this is the first report of the development of a new automatized methodology for screening of microorganisms (native marine bacteria) as producers of QSI compounds. This study allows opening a new field of knowledge in natural products from native marine microorganism. Future global and local studies will be necessary in this field of research.Maestrí