Producción biotecnológica de xilitol a partir de hidrolizados de raquis de palma con levaduras del género Candida sp.

Colombia es el primer productor de palma de aceite en América Latina y cuarto productor mundial. La producción de aceite de palma en el 2017 alcanzó 1’627.552 toneladas. El cultivo tiene presencia en 21 departamentos y 152 municipios de la geografía nacional, congrega el esfuerzo y el trabajo decidido de más de 6.000 productores, de los cuales el 80 % corresponde a pequeños productores, empresarios palmeros de menos de 50 ha. Su producción se encuentra distribuidas en 5 zonas: norte (Atlántico, Bolívar, Cesar y Magdalena), suroccidental (Caquetá y Nariño), oriental (Casanare, Meta y Vichada) y central (Antioquia, Cundinamarca, Norte de Santander y Santander), donde las zonas con mayor producción son la central y oriental. Durante el proceso de extracción de aceite se obtienen residuos sólidos en menor proporción tales como fibras, cáscaras y en mayor proporción los frutos vacíos de palma o “raquis”. En promedio, se producen entre 190 y 250 kg de aceite por tonelada de fruto fresco de palma y entre 260 y 480 kg de residuos sólidos. El 40% de estos residuos se quema directamente para realizar cogeneración energética o el simple calentamiento. El 60% restante se utiliza principalmente para la fertilización y el abono de los campos de palma. Se estima que se producen entre 120 y 260 kg de frutos vacíos de palma o raquis por cada tonelada de fruto fresco de palma. De los racimos de fruta fresca alrededor de 20 a 24% son racimos vacíos o raquis, 11 a 14% son fibras, 5 a 7% es cuesco o cáscara del fruto y 65 a 85% son efluentes líquidos. La incineración o quema del raquis genera un problema ambiental bastante preocupante por la emisión de gases de efecto invernadero. A pesar de emplear el raquis como fertilizante, se necesitan encontrar diferentes alternativas para aprovechar este subproducto y darle valor agregado, teniendo en cuenta el aumento proyectado del cultivo de palma en nuestro país. Por consiguiente, esta biomasa se podría convertir en una materia prima fuente de azúcares fermentables para su conversión a productos de mayor valor agregado. La conversión de los materiales lignocelulósicos a azúcares fermentables se dificulta por la presencia de lignina porque este compuesto restringe el acceso enzimático y microbiológico a la celulosa y hemicelulosa. Por esta razón, se requiere la aplicación de pretratamientos fisicoquímicos y/o biológicos para mejorar su hidrólisis enzimática. La hemicelulosa se constituye principalmente de xilano y este a su vez está constituido por unidades de xilosa que pueden hidrolizarse, ya sea química o biológicamente, a azúcares simples para la producción de una gran variedad de productos químicos, destacándose el xilitol, el cual es un poliol de cinco carbonos que se utiliza actualmente como un edulcorante artificial por tener solo un tercio del total de calorías que contienen otros azúcares como la sacarosa. Además, este poliol se utiliza ampliamente en la industria farmacéutica, chicles, dulces, nutracéuticos, bebidas, pastas dentales y productos cosméticos. Los métodos tradicionales para la conversión de xilosa a xilitol requieren altas presiones y temperaturas, es un proceso que tiene un alto costo de purificación y ambientalmente perjudicial por el uso de agentes químicos. Mientras que, esta misma conversión mediante rutas biotecnológicas utilizando microorganismos constituye una alternativa más económica y amigable con el medio ambiente. Levaduras, como Candida guillermondii y Candida tropicalis, toman la xilosa como fuente de carbono y la convierten a xilitol por medio de la enzima xilosa reductasa. La bioconversión de xilosa a xilitol es un proceso regulado por diferentes factores, tales como la concentración inicial de xilosa, biomasa, pH, tasa de aireación y la presencia de ciertos compuestos en el medio de cultivo como la glucosa y los inhibidores. El estudio de estas variables es fundamental para optimizar el proceso de fermentación con el fin de obtener la mayor conversión de la xilosa bajo diferentes condiciones de proceso y obtener la mayor producción de xilitol. Actualmente no existen trabajos enfatizados en el conocimiento de dichas variables a nivel de biorreactor de tanque agitado, específicamente el control del oxígeno disuelto y su influencia sobre la actividad enzimática como la xilosa reductasa en hidrolizado de raquis de palma de aceite. Este documento se ha dividido en 6 capítulos siguiendo los objetivos de esta investigación. En el Capítulo 1 se evaluó el efecto de diferentes condiciones de proceso como concentración de ácido sulfúrico, tiempo de contacto, relación sólido-líquido y tamaño de partícula, en la recuperación de xilosa y la formación de subproductos a partir del raquis de palma de aceite con hidrolisis ácida diluida. La máxima concentración de xilosa (32.59 g L-1) se obtuvo a 121 °C, por 30 min, con una relación sólido-líquido de 1:8, una concentración de ácido de 2% y un tamaño de partícula de 4 cm. Estos mismos parámetros fueron las condiciones optimizadas del proceso. En el Capítulo 2, se determinó el efecto de diferentes medios de cultivo y de condiciones de fermentación sobre la producción de xilitol, a partir de raquis de palma de aceite, utilizando C. guilliermondii. El hidrolizado ácido de raquis de palma suplementado con 4 g L-1 extracto de levadura, 3 g (NH4)2SO4 L-1, 0.5 g MgSO4.7H2O L-1 y 0.1 g CaCl2.2H2O L-1 mostró ser el mejor medio para el crecimiento de la levadura en cultivo sumergido. Las condiciones de fermentación más apropiadas se obtuvieron con hidrolizado de raquis suplementado a pH de 5.5, concentración inicial de xilosa de 17 g L-1 y un inóculo de 3 g L-1. El nivel de aireación mostró ser un factor importante en el proceso de fermentación; un volumen de 40 mL de medio en un matraz de 100 mL produjo la mayor concentración de xilitol de 6.7 g L-1 (p0.05). Sin embargo, al realizar fermentaciones sucesivas con esta cepa, su capacidad metabólica para la producción de xilitol se veía afectada drásticamente quizás por el tipo de pase (#4) en el que se encontraba; además, no se contaba con una certificación de la cepa para la producción de xilitol. Por estas razones, en las experimentaciones siguientes se decidió cambiar la cepa a Candida tropicalis. En el Capítulo 3, se evaluó la producción biotecnológica de xilitol usando C. tropicalis a partir de hidrolizado de racimos de fruta vacíos de palma de aceite (raquis) detoxificado por el método de carbón activado y overliming; se comparó la producción de xilitol, la xilosa residual y el rendimiento producto/sustrato del mejor pretratamiento con detoxificación frente a un hidrolizado sin detoxificar y se evaluó la producción de biomasa y xilitol en diferentes medios de cultivo como medio sintético de extracto de levadura, peptona, xilosa (YPX), medio-xilosa mínima (MMX) y medio de hidrolizados de raquis sin detoxificar. El uso de carbón activado redujo un 42% la concentración de glucosa, 70% la de ácido acético y 3% la de xilosa. Las mejores condiciones obtenidas para una mayor producción de xilitol (3.5 g L-1) fueron 30 min, pH 2 y una concentración de carbón activado de 2.5%. En la comparación del pretratamiento sin y con detoxificación con carbón activado, se escogió el método sin detoxificar porque se produjo el mayor rendimiento de producto (0.74 g g-1) y se consumió la mayor cantidad de xilosa durante el proceso de fermentación, además de la economía que representaría a escala industrial. Con respecto a la comparación de diferentes medios de cultivo, el mejor medio sintético para la producción de biomasa fue YPX con 2.52 g L-1 a 30 h de fermentación, y el rendimiento de xilitol en medio de hidrolizado de raquis sin detoxificar fue de 0.41 g g-1. En el Capítulo 4 se optimizaron diferentes condiciones de fermentación a través de la metodología de superficie de respuesta (RSM) en la producción de xilitol con C. tropicalis utilizando hidrolizado de raquis de palma no detoxificado. Los parámetros de fermentación optimizados fueron: pH de 6.0, biomasa de 5.42 g L-1, volumen de 26 mL y xilosa inicial de 20 g L-1. A estas condiciones de proceso se obtuvo una predicción de xilitol de 4.3 g L-1 y un valor de xilosa residual de 12.6 g L-1. Asimismo, estas condiciones son el punto de partida para realizar el proceso de escalamiento de la producción de xilitol con C. tropicalis a escala de fermentador de banco. En el Capítulo 5 se evaluó el efecto de la velocidad de agitación y el oxígeno disuelto a escala de biorreactor de tanque agitado de 7 L sobre la producción de la enzima xilosa reductasa (XR) mediante C. tropicalis durante la bioconversión de la xilosa en hidrolizados de raquis de palma de aceite sin detoxificar. El mayor consumo de xilosa (95.5%) y la máxima producción de xilitol (5.46 g L-1) se presentó bajo condiciones de 30% de oxígeno disuelto y 50 rpm. La máxima actividad XR (0.646 U mg-1 proteína) fue obtenida después de 144 h de fermentación a las mismas condiciones mencionadas anteriormente de oxígeno disuelto y velocidad de agitación. En general, el presente trabajo demuestra que la disponibilidad de oxígeno influye en la actividad xilosa reductasa y la producción de xilitol a escala de biorreactor de banco de tanque agitado, utilizando hidrolizados de raquis de palma y C. tropicalis con un rendimiento de xilitol (YP/S) de 0.27 g g-1 y una productividad volumétrica (QP) 0.33 g L-1 h-1. En el Capítulo 6 se aplicaron modelos no estructurados para el crecimiento celular, el consumo de xilosa y la producción de xilitol con el fin de predecir la cinética de fermentación con C. tropicalis en medio sintético YPX (Extracto de levadura, peptona y xilosa) y en hidrolizado de raquis sin detoxificar a escala de matraz de 100 mL con 40 mL de medio. Los parámetros cinéticos fueron estimados para los modelos de crecimiento de Monod, Contois y Tessier. Los resultados demostraron que la velocidad específica máxima de crecimiento (μmax) y el rendimiento celular (YX/S) experimentales se acercaron más a los resultados del modelo de Tessier en medio sintético y al modelo de Contois en hidrolizado de raquis sin detoxificar. Además, los valores de desempeño de las ecuaciones para predecir la fermentación fueron muy similares entre todos los modelos. Con este estudio, se pretende aprovechar la fracción hemicelulósica del raquis de palma utilizando microorganismos cuyas rutas metabólicas conlleven a la producción de xilitol, metabolito de gran aplicación en la industria farmacéutica y de alimentos. Esta investigación busca generar alternativas para solucionar problemas ambientales actuales que sufre el sector palmicultor del país por medio de la generación de valor agregado de un subproducto del sector que es el raquis de palma de aceite. Además, se pretende establecer unas condiciones adecuadas del proceso fermentativo para la obtención de xilitol con el fin de establecer bases apropiadas para el aprovechamiento biotecnológico del material hemicelulósico del raquis de palma.Abstract: The aim of this work was to determine the optimal operation parameters during the batch fermentation by hydrolysate of Oil Palm Empty Fruit Bunch (OPEFB) for the xylitol production with different yeasts of the genus Candida sp. In the optimization of the hydrolysate of OPEFB, the maximum xylose concentration and the minimum production of inhibitors were obtained at 121°C, for 30 min, with a 1:8 solid:liquid ratio, 2% acid concentration and particle size of around 4 cm. At the Erlenmeyer flasks scale, the fermentation conditions that had the highest xylitol production by Candida guilliermondii in supplemented hydrolysates of OPEFB were pH of 5.5, initial xylose concentration of 17 g L-1, inoculum of 3 g L-1 and aeration level with a 40 mL volume in 100 mL flasks. However, it was decided to change the strain to Candida tropicalis in the successive experiments because the C. guilliermondii used did not have a certification of xylitol production and its metabolic capacity could be affected, which could be due to the loss of genetic material that codes for important proteins in the metabolic pathway from xylose to xylitol and the type of pass with which this strain was acquired (# 4). In the evaluation of pretreatment with detoxification with activated charcoal and without detoxification, the latter was selected in the xylitol production by C. tropicalis in hydrolysates of OPEFB because the concentration of inhibitors is minimal and does not affect the strain for the intake of the xylose for the xylitol production, a product yield (0.74 g g-1) is obtained and the greater amount of xylose is consumed during the fermentation process. On the other hand, when applying an optimization to the xylitol production process by C. tropicalis from hydrolysates of OPEFB in Erlenmeyer flask, the following combination of operating conditions was obtained: pH of 6.0, biomass of 5.42 g L-1, volume of 26 mL and initial xylose concentration of 20 g L-1. These conditions were the starting point to carry out the production process of xylitol in a bioreactor by C. tropicalis. The gradual increase of xylose reductase (XR) directly affects a greater amount of xylitol produced in a 7 L bioreactor, demonstrating that the xylitol production could not be favored by high concentrations of XR, but by the behavior of this enzyme during all the fermentation, which should have an increasing tendency without fluctuations in time. The best operating conditions were for 30% dissolved oxygen and a stirring speed of 50 rpm, with a xylose intake of 95.5% and a maximum xylitol production of 5.46 g L-1. During the fermentation process, the maximum XR activity (0.646 U mg-1 protein) was obtained after 144 h at the same conditions mentioned above. This shows that the fermentative process begins to be effective after the fourth day after inoculation of the bioreactor, and that limited oxygen conditions and low agitation speeds favor the xylitol production and the suitable consumption of xylose. Additionally, when applying unstructured models for cell growth and xylitol production both in synthetic medium and hydrolysates of OPEFB in Erlenmeyer flask using C. tropicalis, it was concluded that the Tessier model predicts better the results in synthetic medium and Contois model has better adjustment in non-detoxified hydrolysates of OPEFB. However, it is necessary to bear in mind that this type of process is complex and depends on several variables. In addition, the applicability of biological concepts in models remains limited.Doctorad