Evaluación de la producción metabólica de un aislamiento bacteriano obtenido de ambientes marinos para el control de fitopatógenos

Las enfermedades generadas por agentes fitopatógenos han sido catalogadas como uno de los principales problemas en la producción agrícola. Para controlar los efectos que pueden generan estas enfermedades, los agricultores han optado por el uso indiscriminado de plaguicidas, generando resistencia en los microorganismos patógenos y contaminación en el ambiente. Por esta razón, se han implementado estrategias que busquen disminuir las pérdidas causadas por los fitopatógenos y a su vez reduzcan el impacto sobre el ambiente. Una de estas aproximaciones, es el uso de microorganismos que puedan actuar como controladores del patógeno, disminuyendo así, el impacto que pueden generar el uso de los plaguicidas. En la búsqueda de agentes útiles en biocontrol, ambientes poco explorados como el mar representan una fuente promisoria de microorganismos, que por sus condiciones ambientales se espera que produzcan enzimas y compuestos novedosos con una alta efectividad sobre diversas plagas como bacterias, hongos o incluso insectos. Los resultados de esta exploración obtenidos en nuestro grupo de investigación han sugerido la alta aplicabilidad que tienen los microorganismos aislados de ambientes marinos en el desarrollo de procesos de base biotecnológica para la aplicación del microorganismo o sus compuestos en productos para el biocontrol de plagas agrícolas. En este marco de ideas, en esta investigación se estudiaron 104 bacterias aisladas de ambientes marinos como fuente de compuestos para el control de dos cepas de los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (cepa patógena de clavel) y Colletotrichum gloeosporioides (cepa patógena de ñame). La primera evaluación de la actividad se realizó mediante ensayos de difusión en pozo usando el sobrenadante del cultivo bacteriano, logrando así la selección de 29 de los 104 aislamientos con potencial para el control de fitopatógenos. De estos, se seleccionaron los cinco más activos para evaluar su producción metabólica apoyados en espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) y técnicas de análisis multivariado de datos (MVDA). El resultado de esta evaluación permitió correlacionar la actividad de los extractos orgánicos de Paenibacillus sp. PNM-68 y el aislamiento bacteriano PNM-172 con señales de anillos aromáticos y metilos. Este mismo análisis aplicado a los extractos acuosos correlacionó la actividad observada en los extractos de PNM-172 y de los aislamientos Paenibacillus sp. PNM-163B y Paenibacillus sp. PNM-201 con cambios en la concentración de señales entre 3.6 y 3.8 ppm. Los estudios de la producción metabólica y su correlación con la actividad contra F. oxysporum f. sp. dianthi, permitió la selección del aislamiento bacteriano PNM-172 para realizar el estudio biodirigido de los compuestos responsables de la actividad. Del cultivo de 42 L en medio LB se logró aislar la paenibacillamida, un péptido de nueve residuos, recientemente descrito, cuya estructura se estableció como [2,7-DASDA-Phe-Leu-hLeu-Val-Ile-Leu-Thr-βHVA], por medio de experimentos de RMN mono y bidimensionales, junto con datos de espectrometría de masas y comparación con los datos originales reportados. De la estructura de este péptido se realizó la asignación inequívoca de las señales del residuo de β-hidroxivaleramida (βHVA) y homoleucina (hLeu) empleando experimentos TOCSY-1D-selectivos. También se logró asignar la configuración absoluta de los carbonos alfa de L-Thr y la D-Val, empleando el método de Marfey. Otras fracciones activas por RMN y HPLC-MS mostraron ser una mezcla compleja de compuestos peptídicos análogos a la paenibacillamida. Haciendo uso de redes moleculares como herramienta de derreplicación en mezcla, se lograron detectar otros 15 análogos con iones entre m/z = 887 y m/z = 1161, haciendo evidente la enorme diversidad metabólica que ofrece este aislamiento bacteriano. El presente trabajo contribuyó a la caracterización de la producción metabólica de los aislamientos de la colección del grupo de investigación, las cuales no habían sido abordadas anteriormente, permitiendo la identificación de aislamientos bacterianos y sus compuestos con posible aplicación como biocontroladores.Abstract: The diseases caused by plant pathogens have been classified as one of the main concerns in agricultural production. To control the effects that these diseases can produce, farmers have used pesticides indiscriminately, generating resistance in pathogenic microorganisms and environmental pollution. For this reason, strategies to reduce the crop losses caused by phytopathogens, and at the same time, to reduce the environmental impact, have been implemented. One of these approaches is the use of microorganisms that could act as pathogen controllers, thus decreasing the impact that pesticides can generate. Searching for useful biocontrol microorganisms, several environments such as the marine environment, have been explored by our research group. Results of this exploration suggested the high applicability of microorganisms isolated from marine environments for the development of biotechnological-based products. In this research, 104 bacterial isolates from marine environments were studied as a source of compounds for the control of strains of the phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (pathogenic strain of carnation) and Colletotrichum gloeosporioides (pathogenic strain of yam). The first evaluation of the activity was carried out by well diffusion tests using the bacterial culture supernatant, thus achieving the selection of 29 out of 104 isolates with potential phytopathogens control. Of these, the five most active were selected to evaluate their metabolic production supported by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and multivariate data analysis techniques (MVDA). The result of this evaluation allowed to correlate the activity of organic extracts of Paenibacillus sp. PNM-68 and the bacterial isolate PNM-172 with aromatic rings and methyl signals. The same analysis applied to the aqueous extracts correlated the activity observed in the PNM-172 extracts and the Paenibacillus sp. PNM-163B and Paenibacillus sp. PNM-201 isolates with changes in concentration for compounds with signals between δH 3.6 and 3.8. The metabolic profiling study and its correlation with the activity against F. oxysporum f. sp. dianthi, allowed the selection of bacterial isolate PNM-172 to study the chemical composition of its extract. Its culture (42 L) in LB broth, afforded to isolate paenibacillamide, a nine-residues peptide recently described by us, with a sequence established as [2,7-DASDA-Phe-Leu-hLeu-Val-Ile-Leu-Thr-βHVA]. The unambiguous assignment of the signals of the β-hydroxyvaleramide (βHVA) and homoleucine (hLeu) residues, using TOCSY-1D-selective experiments was carried out. It was also possible to assign the absolute configuration of the alpha carbons of L-Thr and D-Val, using the Marfey’s method. Other active fractions showed to be a complex mixture of peptide compounds similar to paenibacillamide by their NMR and HPLC-MS data. By using molecular networks as a dereplication tool, we were able to detect other 15 analogs with ions between m / z = 887 and m / z = 1161, showing the huge metabolic diversity this isolate offers. The present work contributed to characterize the metabolic production of isolates from the research group collection, as well as the identification of bacterial isolates and their compounds with a possible use as biocontrol agents was allowed.Maestrí