Aislamiento, patogenicidad y transmisión con Scaphytopius marginelineatus (Stal) de un fitoplasma asociado a cuero de sapo en yuca

La yuca Manihot esculenta Crantz constituye un alimento básico en la dieta de millones de personas en el mundo, además, es un cultivo industrial con alto potencial que genera ingresos permanentes para pequeños y medianos agricultores, y aporta al desarrollo social de las regiones donde se cultiva (Howeler, 2014). Dentro de los factores limitantes del cultivo de yuca se encuentran las plagas y enfermedades, las cuales ocasionan pérdidas en su rendimiento; siendo una de gran importancia económica, la conocida como el cuero de sapo. El disturbio causa pérdidas que pueden alcanzar el 90% o más (Pineda y Lozano, 1981; Álvarez et al., 2003; 2009). Los síntomas más característicos se presentan en las raíces, las cuales se tornan leñosas, de cáscara gruesa, corchosa y quebradiza con hendiduras profundas en forma de labios, que unidas entre sí, semejan una red o panal y en estados avanzados el esclerénquima y parénquima se tornan de color café y la epidermis del tubérculo adquiere el aspecto de cuero de sapo que le da el nombre a la enfermedad (Calvert et al., 2004). Las raíces pueden ser muy delgadas, mientras el tocón y los tallos muy gruesos (Chaparro y Trujillo, 2001). Otros síntomas menos sobresalientes como mosaicos, clorosis y distorsiones se observan en la parte aérea (Álvarez, et al., 2009). Por el material vegetativo usado para la siembra, la incidencia y severidad pueden alcanzar niveles epidémicos y desde hace ya más de una década su prevalencia y distribución ha incrementado hasta llegar a departamentos como: Atlántico, Bolívar, Córdoba, Sucre, Magdalena, Arauca, Amazonas, Casanare, Meta, Vaupés, Quindío, Tolima, Huila, Cauca y Valle del Cauca, lo que hace sospechar además, de un posible vector. También se ha reportado en Brasil, Costa Rica, Panamá, Perú y Venezuela (Calvert y Cuervo, 2002; Cuervo et al., 2004; Álvarez et al., 2006). Y reportes recientes confirman su incidencia en Brasil (Oliveira et al., 2014; De Souza et al., 2014) y Paraguay (Cardozo et al., 2016). Además se han registrado síntomas de la enfermedad en cultivos de yuca en China y Tailandia (Comunicación personal, Álvarez, 2016). Los grupos de investigación en Patología de Yuca y La Unidad de Virología Vegetal del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), han venido trabajando durante más de 40 años en el esclarecimiento del agente causante de la enfermedad cuero de sapo en yuca, y los resultados de sus estudios indican la asociación de varios virus y un fitoplasma al disturbio mencionado. A continuación se presenta una breve reseña del estado del arte de la investigación y la ciencia en diferentes tópicos relacionados y que fueron elementos relevantes para el desarrollo de la presente tesis. En primera instancia, los fitoplasmas (anteriormente llamados MLO`s) están citados como agentes causantes de enfermedades en más de 600 especies de plantas, algunas de ellas de gran importancia económica (McCoy et al., 1989; Davis et al., 2015). Además, desde 1967 se detectaron por primera vez, en tubos cribosos del floema de plantas de petunia afectadas con el amarillamiento del aster (Doi et al., 1967). Los mismos autores reportaron que la remisión de síntomas ocurría sólo frente a tratamientos con oxitetraciclina y no con penicilina (Ishiie et al., 1967), encontrando procariontes pleomórficos sin pared, asociados al floema de plantas afectadas por amarillamiento. Estos resultados dieron paso a un reordenamiento en la etiología de algunas enfermedades categorizadas como amarillamientos, que hasta ese momento se consideraban producidas por virus, pero que en realidad eran causadas por fitoplasmas (McCoy et al., 1989; Lee et al., 1994; Maramorosh, 2011). Adicionalmente, la aplicación de tecnologías moleculares resolvió el estatus enigmático de estos procariontes y los ubicó en un grupo denominado Fitoplasmas y posteriormente en una nueva taxa denominada “Candidatus Phytoplasma” (IRPCM, 2004). En otros casos, la etiología fitoplasmática no remplaza la viral, sino que la complementa, es decir se ha determinado también, que virus y fitoplasmas pueden encontrarse de manera simultánea afectando una misma especie vegetal y en cuyo caso la patología se convierte en un complejo, como por ejemplo, lo que ocurre en maíz: Maize Bushy Stunt (Achaparramiento colorado de maíz, fitoplasma), Corn Stunt Spiroplasma (Achaparramiento del maíz, Spiroplasma kunkelii) y varios virus, de los cuales es importante destacar Maize rayado fino Marafivirus (Virus del Rayado fino del maíz), puesto que los tres patógenos son transmitidos por Dalbulus maidis (De long y Wolcott) (Cicadellidae) (Varón y Sarria, 2007; Conci, 2009). Un ejemplo adicional lo representa el síndrome de la hoja amarilla en caña de azúcar, el cual está asociado a un Luteovirus, un fitoplasma 16SrIII en África (Arocha y Jones, 2008), y un fitoplasma del grupo 16SrXII en India (Gaur et al., 2008), los cuales ocurren naturalmente y causan efectos deletéreos sinérgicos sobre la planta afectada. El caso de la enfermedad de cuero de sapo es similar, ésta fue descrita por primera vez, en 1971, en el Departamento del Cauca. En la región amazónica de Colombia y Brasil se le conoce como “lagarto” o “jacaré” debido a la sintomatología observada en las raíces, por cuanto presentan similitud a la piel del lagarto. En la costa norte de Colombia se reportó una enfermedad llamada ‘‘mosaico caribeño’’ por los síntomas en las hojas. Investigaciones posteriores sugirieron que “jacaré”, “lagarto” y “mosaico caribeño” son el mismo “cuero de sapo’’ (Calvert et al., 2001), sospechándose en todo momento de una etiología de tipo viral (CIAT, 1982; Pineda et al., 1983). Algunos estudios realizados en la década de los 80´s, indicaron la presencia de varios virus que afectan la yuca en la región endémica al "cuero de sapo", uno de ellos, denominado virus "X", el cual se registró como asintomático en un amplio rango de clones y otro que produce mosaico severo, distorsión de hojas y síntomas moderados de "cuero de sapo" (CIAT, 1984; Harrison y Lennon, 1986). Luego, investigaciones tendientes a determinar la presencia de vectores de la enfermedad mostraron que porcentajes muy bajos de la población de moscas blancas ( 5%) transmiten el denominado "agente mosaico", el cual fue transmitido por Bemisia tuberculata y, un segundo patógeno, asintomático (denominado CsXV, Potexvirus) por Aleurotrachelus sociales (Ángel et al., 1987). Los autores manifestaron que el papel de los dos virus en la etiología del "cuero de sapo" debía continuar en estudio, puesto que no se recuperaron síntomas en raíces. De otra parte, los efectos epidemiológicos del vector encontrado (B. tuberculata) asociado al agente mosaico, con respecto a la diseminación de la enfermedad, no son severos, puesto que no es la especie más común en las plantaciones de yuca. Por tanto, concluyen Calvert et al. (2001), el control de este vector no es efectivo para controlar la enfermedad. En una revisión hecha por Calvert y Cuervo (2002), referente a enfermedades virales en yuca, plantean que solamente tres tienen importancia económica. El primero es el Mosaico común de la yuca (CsMCV), clasificado como un Potexvirus (Costa y Kitajima, 1972). El segundo es el virus del mosaico de las nervaduras (CVMV), el cual se clasificó como un Pararetrovirus (Calvert et al., 1995), los cuales tienen mayor incidencia en Brasil. Finalmente, afirman que la enfermedad de cuero de sapo es una de las más serias en el cultivo de yuca, puesto que afecta directamente la producción de raíces. En cuanto a la enfermedad cuero de sapo, estudios realizados por la Unidad de Virología del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), demostraron la presencia de partículas isométricas similares a virus de 70 nm de diámetro en tejidos foliares, peciolos, tallos y raíces y la existencia de un ARN de doble cadena de origen viral en tejidos de yuca afectados por cuero de sapo (Cuervo, 1989; Calvert et al., 2004). Así mismo, las técnicas moleculares de RTPCR, hibridación y clonación de ADNc, permitieron postular un virus de la familia Reoviridae asociado a plantas de yuca afectadas por cuero de sapo (Calvert et al., 2004; Calvert et al., 2008). Carvajal et al. (2014) registraron la presencia de cinco tipos de virus diferentes asociados a las plantas de yuca con síntomas de cuero de sapo en Colombia, estos son: Cassava frogskin associated virus (Reoviridae), Cassava New Alphaflexivirus (CsNAV) Potexvirus, Cassava Polero like virus (CsPLV) Luteovirus y dos variantes de Cassava Torrado like virus (CsTLV) Torradovirus Segmentos RNA1 y RNA2. Los autores manifiestan que se presentan en diferentes combinaciones y con diferentes sintomatologías, dependiendo de dichas interacciones. De otra parte, a pesar de que la información generada durante 30 años en el CIAT (1971 – 2002), apuntaba únicamente a una posible etiología viral de la enfermedad cuero de sapo, para el año 2003, Álvarez y colaboradores haciendo uso de la técnica de PCR anidado, detectaron fitoplasmas en tejidos de plantas de yuca de variedades comerciales y con síntomas de cuero de sapo. Adicionalmente, el grupo de patología de yuca en CIAT, mediante pruebas moleculares determinaron la presencia de fitoplasmas del grupo 16 SrIII en plantas de yuca y vinca (Catharanthus roseus L. G. Don) luego de haberlas inoculado usando cuscuta a partir de una planta de yuca enferma por cuero de sapo. Lograron también, la transmisión de los fitoplasmas a plantas sanas mediante injerto de tejidos afectados; remisión de síntomas en plantas de yuca con aplicación de tetraciclina y detectaron con el mismo método fitoplasmas en el Cicadellidae Scaphytopius marginelineatus (CIAT, 2003; 2005), lo cual resultó de gran interés para pruebas de transmisión, ya que los insectos pertenece a una familia que se ha determinado como principal vectora de fitoplasmas a nivel mundial (Maramorosch y Harris, 1980). Posteriormente, aplicando la técnica de RFLP y análisis de secuencia del ADNr amplificado, se determinó que el fitoplasma asociado a yuca, corresponde al grupo 16SrIII. Además, pruebas de PCR con cebadores específicos para este grupo y para el gen rARN (proteína ribosomal rp), indicaron que difiere de todos los fitoplasmas descritos anteriormente dentro del grupo 16SrIII. Sobre esta base se clasificó tentativamente en un nuevo subgrupo denominado 16SrIIIL y rpIII-H respectivamente (Álvarez et al., 2009). En búsqueda de posibles microrganismos vectores presentes en suelo, se desarrollaron experimentos con suelo procedente de lotes donde la enfermedad fue registrada epidémicamente. Se montaron ensayos en invernadero con la variedad M Tai 8, la cual es altamente susceptible. Los resultados permitieron descartar la posible influencia del suelo como fuente de inóculo o potenciales vectores (CIAT, 2003). En el mismo año, se probaron aislamientos patogénicos de Agrobacteium tumefaciens, que inoculados en yuca no permitieron reproducción de síntomas de cuero de sapo. Los anteriores resultados mostraron una nueva posibilidad de explicar la naturaleza etiológica del cuero de sapo y surgieron opciones diferentes de investigación con el objetivo de avanzar en el conocimiento de la enfermedad y su causa. Todos los aportes hechos por el grupo de patología de yuca, revelaron evidencia de un fitoplasma asociado a plantas enfermas y la necesidad de comprobar su efecto sobre la planta. En 2013, Pardo, diseñó sondas TaqMan® y cebadores, a partir del gen rp para la detección del fitoplasma (16SrIII-L) y ARN 4 para el reovirus CFSV. Para la detección simultánea de los dos microrganismos asociados a la enfermedad cuero de sapo en yuca. La técnica de qPCR desarrollada, presentó una sensibilidad en la detección de 100 y 1000 veces en comparación con RT-PCR y PCR anidado respectivamente; mostrando para la detección de fitoplasma una excelente correlación entre la presencia de síntomas en raíces enfermas y el porcentaje de detección (92.5%), mientras que el virus presentó un porcentaje de 76.47%. Finalmente, pocos son los casos de aislamientos exitosos de fitoplasmas en medios de cultivo, destacándose los resultados obtenidos por Skripal et al., (1984) y (Poghosyan y Lebsky, 2004), los cuales tuvieron éxito haciendo uso del medio de cultivo CMIMB-72, que infortunadamente no se produce comercialmente. Pero, los novedosos resultados aportados por Contaldo et al. (2012), quienes lograron crecer fitoplasmas de diferentes grupos en un medio de cultivo artificial (patentado), provee herramientas adicionales para el estudio de estos microrganismos y poder confirmar si son los causantes de la enfermedad a través de los postulados de Koch. En este documento de investigación, el lector podrá encontrar a través de tres capítulos el aislamiento, pruebas de patogenicidad y transmisión por un vector del fitoplasma 16SrIIIl de yuca, en la cual se demostró biológica y genéticamente que es la causa de la enfermedad de cuero de sapo, manifestando síntomas en infección individual.//Abstract: In Colombia, the '' Frogskin '' is the most cassava disease limiting, cause’s losses in production of roots to 90%. Studies of the International Center for Tropical Agriculture indicate that its nature can be viral or phytoplasmatic; but it has not confirmed the cause. The investigation goal was to achieve in vitro isolation of phytoplasma associated with Frogskin. For this purpose, liquid (PivL) and solid (PivS) culture media developed by Contaldo et al (2012) and produced by Mycoplasma Experience Ltd and tissues of roots, stalks, stems, leaves and seeds of cassava affected by the disease were used. Molecular studies of PCR, qPCR, RFLP, sequencing, light and electron microscopy were required to check the growth of phytoplasma and rule out the presence of other microorganisms. The results indicated that the PivL and PIVS media consistently allow the growth of phytoplasma, obtaining colonies on solid media from liquid medium with color change (pH indicator) and PCR, qPCR and sequencing assays, confirmed the presence of Cassava frogskin phytoplasma of 16SrIII group in both culture media. The technique of resin immersion to transmission electron microscope examination, allowed photographs of cells with morphology and size similar to phytoplasms. It is the first time in the world that sufficient information consolidated about of isolation phytoplasma in artificial medium. In addition, the isolation of Pigeon pea witches'broom phytoplasma of group IX be achieved, using stems, petioles and flowers of vinca (Catharanthus roseus) with symptoms caused by phytoplasma. This process corroborated the effectiveness of medium and morphology under electron microscopy of phytoplasma cells.Doctorad